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文檔簡介
1、目的:探討miR-133a、miR-326對肝癌HepG2細胞5-氟尿嘧啶、阿霉素和順鉑化療藥物敏感性的影響及作用機制。
方法:生物信息學軟件預測ABCC1基因3′UTR潛在的miRNA結合位點;雙熒光素酶報告基因驗證 miR-133a、miR-326對 ABCC1的靶向作用;實時定量RT-PCR檢測miRNAs的轉染效率及ABCC1 mRNA表達水平;Western blot檢測ABCC1蛋白表達水平;MTT法檢測細胞對三種
2、化療藥物的敏感性。
結果:生物信息學預測軟件顯示ABCC1基因3′UTR存在一個miR-133a的結合位點和兩個miR-326的結合位點。miR-133a的潛在保守結合位點位于 ABCC13′UTR366-372 nt,miR-326的潛在結合位點位于ABCC13′UTR3-9 nt和1614-1621 nt。
實時熒光定量RT-PCR結果顯示,在miR-133a或miR-326 mimics轉染的HepG2細胞中,
3、miR-133a或miR-326的表達水平顯著升高(MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的相對活性倍數(shù)分別為1、0.98、14.42和14.83);與NC轉染組相比,miR-133a或miR-326 mimics轉染組的ABCC1表達水平顯著降低(MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的相對活性倍數(shù)分別為1、1.03、0.69和0.78)。
Western blot結果顯示,與NC轉染組相比,miR-
4、133a或miR-326mimics轉染組的ABCC1蛋白表達水平顯著降低(MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的ABCC1/β-actin灰度比值分別為2.25、2.18、0.85和0.98)。
MTT檢測結果顯示,與未處理組細胞及 NC轉染組相比,miR-133a或miR-326 mimics轉染組的HepG2細胞對三種化療藥物的敏感性均增強,其中5-FU處理的未轉染組、NC組、miR-133a轉染組和miR
5、-326轉染組的IC50分別為3026.7±236.7μM、2074.8±173.1μM、106.8±18.7μM和864.8±20.5μM;ADM處理的未轉染組、NC組、miR-133a轉染組和 miR-326轉染組的IC50分別為0.86±0.15μM、0.76±0.05μM、0.49±0.12μM和0.55±0.04μM;DDP處理的未轉染組、NC組、miR-133a轉染組和miR-326轉染組的IC50分別為21.70±5.28
6、μM、20.15±3.24μM、14.00±2.32μM和16.19±3.18μM。
雙熒光素酶報告基因載體驗證實驗結果表明:與miRNA陰性對照(NC)+野生型ABCC13′UTR載體共轉染組比較,miR-133amimics+野生型ABCC13′UTR載體共轉染組熒光素酶活性顯著降低(將未轉染組設定為1,NC組雙熒光素酶活性倍數(shù)為1,miR-133a與野生型載體共轉染組的雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.49),與NC+突變型ABC
7、C13′UTR載體共轉染組比較,miR-133amimics+突變型ABCC13′UTR載體共轉染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.98,無明顯變化;miR-326 mimics+野生型ABCC13′UTR載體共轉染組熒光素酶活性同樣顯著降低(將未轉染組設定為1,NC組雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.99,miR-326與野生型載體共轉染組的雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.50),與NC+突變型ABCC13′UTR載體共轉染組比較,miR-326mimics+第
8、一個位點突變的突變型ABCC13′UTR載體1共轉染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.38,有極顯著統(tǒng)計學差異,說明第一個位點不保守。miR-326mimics+第二個位點突變的突變型ABCC13′UTR載體2共轉染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.79,有顯著統(tǒng)計學差異,說明第二個位點相對保守。miR-326 mimics+兩個位點同時突變的突變型ABCC13′UTR載體3共轉染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.91,沒有統(tǒng)計學差異。
結論:
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