miR-133a與miR-326靶向ABCC1對(duì)HepG2藥物敏感性的影響.pdf

1、目的：探討miR-133a、miR-326對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞5-氟尿嘧啶、阿霉素和順鉑化療藥物敏感性的影響及作用機(jī)制。
　　方法：生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)ABCC1基因3′UTR潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證 miR-133a、miR-326對(duì) ABCC1的靶向作用；實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)miRNAs的轉(zhuǎn)染效率及ABCC1 mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)ABCC1蛋白表達(dá)水平；MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)三種

2、化療藥物的敏感性。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件顯示ABCC1基因3′UTR存在一個(gè)miR-133a的結(jié)合位點(diǎn)和兩個(gè)miR-326的結(jié)合位點(diǎn)。miR-133a的潛在保守結(jié)合位點(diǎn)位于 ABCC13′UTR366-372 nt，miR-326的潛在結(jié)合位點(diǎn)位于ABCC13′UTR3-9 nt和1614-1621 nt。
　　實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，在miR-133a或miR-326 mimics轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中，

3、miR-133a或miR-326的表達(dá)水平顯著升高（MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的相對(duì)活性倍數(shù)分別為1、0.98、14.42和14.83）；與NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-133a或miR-326 mimics轉(zhuǎn)染組的ABCC1表達(dá)水平顯著降低（MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的相對(duì)活性倍數(shù)分別為1、1.03、0.69和0.78）。
　　Western blot結(jié)果顯示，與NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-

4、133a或miR-326mimics轉(zhuǎn)染組的ABCC1蛋白表達(dá)水平顯著降低（MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的ABCC1/β-actin灰度比值分別為2.25、2.18、0.85和0.98）。
　　MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與未處理組細(xì)胞及 NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-133a或miR-326 mimics轉(zhuǎn)染組的HepG2細(xì)胞對(duì)三種化療藥物的敏感性均增強(qiáng)，其中5-FU處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-133a轉(zhuǎn)染組和miR

5、-326轉(zhuǎn)染組的IC50分別為3026.7±236.7μM、2074.8±173.1μM、106.8±18.7μM和864.8±20.5μM；ADM處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-133a轉(zhuǎn)染組和 miR-326轉(zhuǎn)染組的IC50分別為0.86±0.15μM、0.76±0.05μM、0.49±0.12μM和0.55±0.04μM；DDP處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-133a轉(zhuǎn)染組和miR-326轉(zhuǎn)染組的IC50分別為21.70±5.28

6、μM、20.15±3.24μM、14.00±2.32μM和16.19±3.18μM。
　　雙熒光素酶報(bào)告基因載體驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與miRNA陰性對(duì)照(NC)+野生型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組比較，miR-133amimics+野生型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低（將未轉(zhuǎn)染組設(shè)定為1，NC組雙熒光素酶活性倍數(shù)為1，miR-133a與野生型載體共轉(zhuǎn)染組的雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.49），與NC+突變型ABC

7、C13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組比較，miR-133amimics+突變型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.98，無(wú)明顯變化；miR-326 mimics+野生型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性同樣顯著降低（將未轉(zhuǎn)染組設(shè)定為1，NC組雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.99，miR-326與野生型載體共轉(zhuǎn)染組的雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.50），與NC+突變型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組比較，miR-326mimics+第

8、一個(gè)位點(diǎn)突變的突變型ABCC13′UTR載體1共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.38，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明第一個(gè)位點(diǎn)不保守。miR-326mimics+第二個(gè)位點(diǎn)突變的突變型ABCC13′UTR載體2共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.79，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明第二個(gè)位點(diǎn)相對(duì)保守。miR-326 mimics+兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變的突變型ABCC13′UTR載體3共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.91，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：