miR-133a與miR-326靶向ABCC1對HepG2藥物敏感性的影響.pdf

1、目的：探討miR-133a、miR-326對肝癌HepG2細(xì)胞5-氟尿嘧啶、阿霉素和順鉑化療藥物敏感性的影響及作用機(jī)制。
　　方法：生物信息學(xué)軟件預(yù)測ABCC1基因3′UTR潛在的miRNA結(jié)合位點；雙熒光素酶報告基因驗證 miR-133a、miR-326對 ABCC1的靶向作用；實時定量RT-PCR檢測miRNAs的轉(zhuǎn)染效率及ABCC1 mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測ABCC1蛋白表達(dá)水平；MTT法檢測細(xì)胞對三種

2、化療藥物的敏感性。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測軟件顯示ABCC1基因3′UTR存在一個miR-133a的結(jié)合位點和兩個miR-326的結(jié)合位點。miR-133a的潛在保守結(jié)合位點位于 ABCC13′UTR366-372 nt，miR-326的潛在結(jié)合位點位于ABCC13′UTR3-9 nt和1614-1621 nt。
　　實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，在miR-133a或miR-326 mimics轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中，

3、miR-133a或miR-326的表達(dá)水平顯著升高（MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的相對活性倍數(shù)分別為1、0.98、14.42和14.83）；與NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-133a或miR-326 mimics轉(zhuǎn)染組的ABCC1表達(dá)水平顯著降低（MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的相對活性倍數(shù)分別為1、1.03、0.69和0.78）。
　　Western blot結(jié)果顯示，與NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-

4、133a或miR-326mimics轉(zhuǎn)染組的ABCC1蛋白表達(dá)水平顯著降低（MOCK、NC、miR-133a和miR-326組的ABCC1/β-actin灰度比值分別為2.25、2.18、0.85和0.98）。
　　MTT檢測結(jié)果顯示，與未處理組細(xì)胞及 NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-133a或miR-326 mimics轉(zhuǎn)染組的HepG2細(xì)胞對三種化療藥物的敏感性均增強(qiáng)，其中5-FU處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-133a轉(zhuǎn)染組和miR

5、-326轉(zhuǎn)染組的IC50分別為3026.7±236.7μM、2074.8±173.1μM、106.8±18.7μM和864.8±20.5μM；ADM處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-133a轉(zhuǎn)染組和 miR-326轉(zhuǎn)染組的IC50分別為0.86±0.15μM、0.76±0.05μM、0.49±0.12μM和0.55±0.04μM；DDP處理的未轉(zhuǎn)染組、NC組、miR-133a轉(zhuǎn)染組和miR-326轉(zhuǎn)染組的IC50分別為21.70±5.28

6、μM、20.15±3.24μM、14.00±2.32μM和16.19±3.18μM。
　　雙熒光素酶報告基因載體驗證實驗結(jié)果表明：與miRNA陰性對照(NC)+野生型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組比較，miR-133amimics+野生型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低（將未轉(zhuǎn)染組設(shè)定為1，NC組雙熒光素酶活性倍數(shù)為1，miR-133a與野生型載體共轉(zhuǎn)染組的雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.49），與NC+突變型ABC

7、C13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組比較，miR-133amimics+突變型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.98，無明顯變化；miR-326 mimics+野生型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性同樣顯著降低（將未轉(zhuǎn)染組設(shè)定為1，NC組雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.99，miR-326與野生型載體共轉(zhuǎn)染組的雙熒光素酶活性倍數(shù)為0.50），與NC+突變型ABCC13′UTR載體共轉(zhuǎn)染組比較，miR-326mimics+第

8、一個位點突變的突變型ABCC13′UTR載體1共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.38，有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異，說明第一個位點不保守。miR-326mimics+第二個位點突變的突變型ABCC13′UTR載體2共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.79，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，說明第二個位點相對保守。miR-326 mimics+兩個位點同時突變的突變型ABCC13′UTR載體3共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性倍數(shù)為0.91，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：