烏骨藤注射液對Bel-7402細胞增殖及血管生成作用的實驗研究.pdf

1、1.目的： 近年來，抗腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的基礎和臨床研究熱點，是最有希望的腫瘤導向治療靶標，與傳統(tǒng)的腫瘤治療相比，抗腫瘤血管生成治療的最大特點在于它不但具有良好的特異性，而且克服了藥物達到腫瘤組織的不足和腫瘤耐藥性等問題。我國的中醫(yī)藥治療與血管生成相關(guān)的病癥有著悠久的歷史，具有不同于西醫(yī)的特殊性，并在這些病癥的治療上有極大的優(yōu)勢。因此，研究中藥抗腫瘤血管生成，在闡明中醫(yī)基礎理論、臨床治療及中藥研究中具有十分重要的意義。烏

2、骨藤，又叫通光藤，為蘿藦科牛奶菜屬植物，主產(chǎn)于云南、貴州，據(jù)記載：該藥始載于《滇南本草》，性味苦，微甘、涼，入肺胃膀胱經(jīng)；具有止咳平喘、消炎鎮(zhèn)痛、通乳利尿等功效，用于治療慢性支氣管炎。民間用烏骨藤治療癌癥獲得良效，引起廣大醫(yī)藥工作者的關(guān)注。本試驗旨在研究并證明傳統(tǒng)中藥烏骨藤抗腫瘤活性，從血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2以及抑癌基因p53等角度探討烏骨藤的抗腫瘤作用機制。 2.方法： 2.1 M

3、TT法 采用四氮唑鹽(MTT)還原法測定不同濃度的烏骨藤注射液的體外對人肝癌細胞Bel-7402細胞增殖的影響，并根據(jù)吸光度(OD)值作圖得到劑量-效應圖譜。 2.2 PI單染法檢測細胞凋亡和周期 采用流式細胞術(shù)檢測不同濃度的烏骨藤注射液對人肝癌細胞Bel-7402凋亡和周期的影響。 2.3 ELASI法 利用ELASI試劑盒檢測不同濃度的烏骨藤注射液對人肝癌細胞Bel-7402不同時間段表達VE

4、GF的影響。 2.4免疫細胞化學法 采用細胞免疫化學S-P染色法檢測不同濃度的烏骨藤注射液作用于人肝癌細胞Bel-7402后b-FGF和MMP-2蛋白的陽性表達率。 2.5流式細胞術(shù)檢測抑癌基因p53蛋白的表達 采用流式細胞術(shù)，通過間接熒光標記法測定不同濃度的烏骨藤注射液作用于人肝癌細胞Bel-7402后p53蛋白的表達情況。p53蛋白熒光指數(shù)(FluoresenceIndex，F(xiàn)I)表示定量的p53蛋白

5、。綠熒光LOG收集的熒光強度峰值數(shù)轉(zhuǎn)化成線性刻度，對照管作為陰性表達FI=1。FI計算公式如下：FI=檢測管細胞平均熒光強度/對照管細胞平均熒光強度。如FI>1.0為陽性表達，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達。 3.結(jié)果： 3.1不同濃度的烏骨藤注射液(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml)對人肝癌細胞Bel-7402均有抑制作用，且呈劑量時間依賴，經(jīng)統(tǒng)計學分析有差異。 3.2人肝癌細胞Bel-7402經(jīng)不同濃度

6、的烏骨藤注射液(20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml)作用后，細胞凋亡率明顯上升，且呈劑量依賴，經(jīng)統(tǒng)計學分析有意義。然而，細胞周期變化不大，未證實細胞被阻滯于特定周期。 3.3利用ELASI試劑盒檢測不同濃度的烏骨藤注射液(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml)作用于人肝癌細胞Bel-7402后VEGF的表達情況，隨著藥物濃度的增加，VEGF表達逐漸減少，且與陰性對照組相比均有統(tǒng)計學差異。 3.4免疫

7、細胞化學的結(jié)果顯示，不同濃度的烏骨藤注射液(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml)作用于人肝癌細胞Bel-7402后，與陰性對照組相比，b-FGF和MMP-2的表達均有所減少，經(jīng)統(tǒng)計學分析有差異。 3.5流式細胞免疫熒光檢測p53蛋白的結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，熒光強度增加，p53峰總體向右偏移。根據(jù)FI計算公式計算出FI值，經(jīng)不同濃度的烏骨藤注射液作用24h后，p53均陽性表達，且FI值隨劑量的增加而增高。