餅粕蛋白酶解產(chǎn)物對異育銀鯽生長發(fā)育影響及其生物效價分析的研究.pdf

1、植物蛋白酶解后會產(chǎn)生活性肽類，活性肽不僅有營養(yǎng)作用，而且能促進(jìn)動物生長、提高免疫機(jī)能、增強(qiáng)抗病能力等。本研究選用餅粕植物蛋白作為酶解底物，以幾種內(nèi)切蛋白酶類對餅粕植物蛋白進(jìn)行酶解，對其蛋白酶解產(chǎn)物生物效價進(jìn)行分析，并將其酶解產(chǎn)物添加到飼料中喂養(yǎng)魚類，探討蛋白酶解產(chǎn)物對魚類生長發(fā)育的影響及其影響機(jī)制，為植物蛋白酶解產(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 1、酶解豆粕蛋白適宜酶類及其酶解條件篩選
　　 通過正交試驗設(shè)計（L9（3

2、4）），分別對木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和As1.398枯草蛋白酶等三種酶解大豆粕的水解條件中的PH，溫度、時間、酶濃度進(jìn)行了適宜范圍的篩選。試驗共分27組，酶解結(jié)束后分別對27組酶解產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析和水解度測定，并以水解度為衡量指標(biāo)，對三種酶解大豆粕的水解條件篩選結(jié)果表明：木瓜蛋白酶水解大豆粕的最佳條件為：PH7.0、溫度60℃、時間5h、酶濃度5％，在此條件下，大豆粕的水解度可達(dá)到3.67％；胰蛋白酶水解大豆粕的最佳條件為：P

3、H7，溫度50℃、時間7h、酶濃度5％，在此條件下，大豆粕的水解度可達(dá)到5.53％；As1.398蛋白酶水解大豆粕的最佳條件為：PH6.5、溫度50℃、時間7h、酶濃度5％，在此條件下，可使大豆粕的水解度達(dá)到8.73％。因此，在這三種酶種以As1.398枯草蛋白酶對豆粕酶解能力最強(qiáng)。
　　 2、常見幾種餅粕蛋白酶解產(chǎn)物的超濾與電泳比較分析
　　 用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Asp1.398枯草蛋白酶酶解豆粕、棉粕、菜粕和花生

4、粕，采用超濾法結(jié)合SDS-PAGE電泳法對其酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明：Asp1.398枯草蛋白酶酶解豆粕效果最好，其次是胰蛋白酶，木瓜蛋白酶最差，豆粕水解度越大的，其低分子量的蛋白質(zhì)與肽類等物質(zhì)越多，水解度為5.68％，30KD以上占73.09％，10KD-30KD占2.75％，3KD-10KD占13.42％，3KD以下10.75％；水解度為8.73％，30KD以上占44.87％，10KD-30KD占8.83％，3KD-10KD占14

5、.63％，3KD以下31.67％：而原料蛋白未水解，30KD以上占94.12％，10KD-30KD占3.06％，3KD-10KD占1.86％，3KD以下只有0.97％。在相同條件下，Asp1.398枯草蛋白酶對豆粕蛋白酶解程度最高，10KD以下的小分子蛋白質(zhì)和氨基酸總比例為46.3％，其次為棉粕25.13％，花生粕和菜粕較小，分別為13.38％和12.58％。這在SOS-PAGE電泳圖譜中也能反映出來，其水解度越大，蛋白帶越少。

6、　　 3、植物蛋白酶解產(chǎn)物對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生長的影響
　　 用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、As1.398枯草蛋白酶分別對豆粕、棉粕、菜粕和花生粕等四種植物蛋白進(jìn)行酶解，用酶解產(chǎn)物對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)試驗研究，探討不同酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)組分對細(xì)胞生長的影響。結(jié)果表明，各種酶解產(chǎn)物對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的生長都有促進(jìn)作用，而棉粕的As1.398枯草蛋白酶酶解產(chǎn)物對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞促生長效果最好。其對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞促生長速度

7、比豆粕、菜粕和花生粕酶解產(chǎn)物都快，且差異顯著（P<0.05）。
　　 4、餅粕蛋白及其酶解物對魚類腸道微生物體外培養(yǎng)的影響
　　 用平板法從健康魚類腸道中分離得到三種不同的微生物：大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌，再用液體培養(yǎng)法研究了四種植物性蛋白及其酶解物在體外對這三種微生物生長的影響。結(jié)果表明，除菜粕原料蛋白外，棉粕、豆粕、花生粕等原料蛋白及棉粕、豆粕、菜粕、花生粕等蛋白酶解物對芽孢桿菌、乳酸桿菌促生長作用明顯，差異均顯

8、著（P<0.05）；除棉粕酶解物對大腸桿菌有促生長作用外，四種原料蛋白及其酶解物對大腸桿菌的促生長作用均不明顯，差異不顯著（P>0.05）。
　　 5、餅粕蛋白酶解產(chǎn)物對異育銀鯽生長和免疫指標(biāo)的影響
　　 以基礎(chǔ)日糧為對照，將棉粕、菜粕、豆粕、花生粕的酶解物和魚粉添加于異育銀鯽飼料中，喂養(yǎng)61天，結(jié)果表明：試驗各組異育銀鯽增重率與對照組相比均有提高，餌料系數(shù)也相應(yīng)下降，添加棉粕酶解物組增重率最高，與對照組相比提高32.1

9、3％，且差異顯著（P<0.05），其它各組增重率比對照組分別提高了3.67％、5.83％、12.17％、11.66％，但差異不顯著（P>0.05）。棉粕酶解物組的酸性磷酸酶（ACP），溶菌酶活力與對照組相比有顯著提高（P<0.05），其它各試驗組的超氧化物歧化酶（SOD），酸性磷酸酶（ACP），堿性磷酸酶（AKP）和溶菌酶（UL）的活力與對照組相比的活力均無顯著差異。
　　 在以上幾個試驗中，通過對餅粕蛋白酶解產(chǎn)物的化學(xué)分析和生

10、物效價分析得出初步結(jié)論，棉粕的枯草蛋白酶酶解產(chǎn)物的小肽數(shù)量和生物效價均較高，所以在以下兩個試驗中，我們進(jìn)一步對棉粕酶解產(chǎn)物進(jìn)行高效液相分析及其對異育銀鯽生長發(fā)育、消化機(jī)能和胰蛋白酶基因表達(dá)量的研究，探討蛋白酶解產(chǎn)物對魚類的影響效果和作用機(jī)制。
　　 6、棉粕蛋白酶解產(chǎn)物組份的凝膠層析和HPLC分析
　　 通過常規(guī)測定、凝膠層析、高效液相色譜等三種方法，測定和分析了棉粕及其As1.398枯草蛋白酶酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)組份，并進(jìn)

11、行比較研究。結(jié)果表明：棉粕經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶酶解后，可溶性蛋白比例比原來增加了1倍，游離氨基酸的含量是原來的3.9倍；棉粕原料和酶解后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物經(jīng)過SephadexG-50、SephadexG-25凝膠層析分離后均得到兩個主要蛋白峰，期分子量均超過6000KD，但酶解物的兩個峰所含蛋白量均比原料中多；用高效液相色譜法分析可知棉粕原料含有較多大分子蛋白，而酶解物中大分子蛋白含量下降了7.71％，小肽（2-10肽）的含量由27.04％增加

12、到66.78％，游離氨基酸的含量也增加較多。由此可見，棉粕蛋白酶解后能產(chǎn)生豐富的肽類物質(zhì)，小肽及游離氨基酸的增加有利于動物機(jī)體的直接吸收利用，能更快地促進(jìn)動物的生長發(fā)育。
　　 7、棉粕蛋白酶解物對異育銀鯽消化、生長和胰蛋白酶mRNA表達(dá)量的影響
　　 為了探討棉粕蛋白酶產(chǎn)物及添加量對異育銀鯽生長，消化蛋白酶活性及胰蛋白酶mRNA表達(dá)水平的影響，并研究魚類生產(chǎn)性能及各項生化指標(biāo)與蛋白酶活性之間的相互關(guān)系。本研究以棉粕蛋白

13、酶解底物，用枯草桿菌蛋白酶對其進(jìn)行酶解，以酶解產(chǎn)物的混合物1.5％和3.0％兩個梯度等量替代魚飼料中棉粕在室內(nèi)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中喂養(yǎng)異育銀鯽魚種（體重30±2g）65天。測定魚類的生長，營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、消化蛋白酶活性及肝胰臟中蛋白酶mRNA表達(dá)水平等指標(biāo)。結(jié)果表明：添加1.5％和3.0％棉粕酶解產(chǎn)物兩組魚類在飼養(yǎng)35天后的增重率分別比對照組高8.96％和44.24％，且差異顯著（p<0.05），在飼養(yǎng)65天后，兩組增重率分別比對照組高3