分泌型抗骨肉瘤單鏈雙功能抗體融合蛋白的生物活性的預測及分析.pdf

1、目的：利用生物信息學網(wǎng)絡資源分析融合蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)，進一步構(gòu)建分泌型抗骨肉瘤單鏈雙功能抗體基因，探討分泌型抗骨肉瘤單鏈雙功能抗體基因表達并分泌針對成骨肉瘤細胞的靶向性ScFv-TNF融合蛋白。 方法：融合蛋白的親和性及抗腫瘤活性分別較衍生因子的功能及活性有所變化，可能由于融合蛋白結(jié)構(gòu)變化導致功能及活性的變化，抗體融合的重組設計實際上只受想象和能夠產(chǎn)生正確折疊蛋白產(chǎn)物的表達系統(tǒng)的限制。我們在構(gòu)建融合蛋白時，選用了通用酶

2、切位點序列，然后運用DNA分析軟件(DNAssist)和蛋白質(zhì)分析軟件(ANTHEPROTV5)分析預測融合蛋白的氨基酸序列、二級結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)。首先采用PCR方法將人工合成的抗體分泌信號肽序列加在抗骨肉瘤ScFv(singlechainvariableregionfragmentsantibody)基因5'端，其3'與人的腫瘤壞死因子TNF基因連接構(gòu)成分泌型單鏈雙功能抗體ScFv-TNF基因，將該基因克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體PLxS

3、N，構(gòu)建抗骨肉瘤單鏈雙功能抗體基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pL(ScFv-TNF)SN，重組質(zhì)粒pL(ScFv-TNF)SN在脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染PA317包裝細胞，G418篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆，擴大培養(yǎng)，用NIH3T3測定病毒滴度，將重組病毒感染人骨肉瘤OC9901細胞，G418篩選出抗性克隆，命名為OC/ScFv-TNF,以PCR，RT-PCR以及Westernblotting對ScFv-TNF基因修飾的OC9901細胞進行鑒定。

4、結(jié)果：通過重組PCR方法在編碼ScFv與TNF的堿基之間引入酶切位點獲得的DNA序列，運用DNAssist核酸序列分析軟件分析ScFv-TNFDNA序列翻譯并獲得了氨基酸序列及其開放性閱讀框架，并運用蛋白質(zhì)分析軟件(ANTHEPROTV5)分析融合蛋白的二級結(jié)構(gòu)，分析融合蛋白的理化性質(zhì)及其潛在的信號肽與斷裂位點。構(gòu)建完成的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pL(ScFv-TNF)SN，首先用EcoRI和BamHI雙酶切下930bp左右的片段，符合ScF

5、v-TNF片段大小，pL(ScFv-TNF)SN進一步EcoR1和Xho1及Xho1和BamH1分別雙酶切鑒定，分別切下470bp左右及460bp左右的片段，符合TNF及ScFv片段大小。經(jīng)測序，限制性酶切分析及PCR方法鑒定，各插入基因序列的大小，位置及其方向均正確無誤，成功地構(gòu)建了不同基因組合的瞬時表達載體pEGFP-ScFv-TNF。構(gòu)建了融合不同基因表達載體pL(ScFv-TNF)SN；獲得高滴度產(chǎn)毒細胞株C26，滴度分別為6×

6、108CFU/L；PCR，RT-PCR及Westernblotting分析證明ScFv-TNF基因已整合至OC9901細胞基因組中，并在mRNA水平上表達。 結(jié)論：探討分泌型抗骨肉瘤單鏈雙功能抗體基因表達并分泌針對骨肉瘤細胞的靶向性ScFv-TNF融合蛋白以及利用生物信息學網(wǎng)絡資源探討和分析融合蛋白的二級結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)及其潛在的信號肽與斷裂位點的信息。為進一步構(gòu)建分子量盡可能小，免疫原性盡可能弱的分泌型抗骨肉瘤單鏈雙功能抗體基因

7、，采用PCR方法在抗骨肉瘤ScFv的5'端加上引導序列、3'端連上人的腫瘤壞死因子TNF基因，構(gòu)建成功了分泌型抗骨肉瘤單鏈雙功能抗體基因，并將該基因克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體PLxSN，構(gòu)建抗骨肉瘤單鏈雙功能抗體基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pL(ScFv-TNF)SN。生物信息學可以促進藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程，即充分利用生物信息學的生物學和遺傳學信息來尋找和開發(fā)以基因為基礎的藥物。各融合蛋白的研究成果，可見決定融合蛋白的生物活性的主要因素可能包括