腎臟損傷機(jī)制及防治藥物的篩選和評(píng)價(jià).pdf

1、腎臟是人體內(nèi)最常見也是最容易損傷的器官之一，除了外力的機(jī)械性損傷外，內(nèi)源性因素如高尿酸血癥、糖尿病以及免疫因素等都可以引起嚴(yán)重的腎臟損傷；外源性因素如化學(xué)物質(zhì)、藥物等，也是引起腎臟損傷的重要原因。此外腎臟具有兩級(jí)毛細(xì)血管網(wǎng)，血管分布密集，血管功能是維持腎臟功能的重要條件。 高尿酸是近年發(fā)現(xiàn)的損傷血管和腎臟功能的重要內(nèi)源性因素，而二甘醇是導(dǎo)致腎臟損傷的外源性化學(xué)物質(zhì)，但高尿酸和二甘醇對(duì)腎臟和血管的損傷作用及針對(duì)該損傷的防治藥物很少

2、有研究。因此本研究以高尿酸和二甘醇作為腎臟損傷的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)代表，系統(tǒng)研究其產(chǎn)生損傷的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上，篩選能夠抑制損傷物質(zhì)生成、促進(jìn)其排泄、增強(qiáng)腎臟抗損傷作用的活性化合物，并評(píng)價(jià)其作用和作用機(jī)制。 本研究得到以下基金項(xiàng)目資助：國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目：創(chuàng)新藥物和中藥現(xiàn)代化重大專項(xiàng)“創(chuàng)新藥物篩選技術(shù)平臺(tái)的研究和應(yīng)用”，NO：2004AA273782。國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：中藥復(fù)方活性成分的高通量篩選研究

3、，NO：30171148。國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：高通量藥物篩選與中藥大規(guī)模集成研究體系，NO：3001161940。 本課題在中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)&中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國(guó)家藥物篩選中心完成。 一、高尿酸對(duì)血管和腎臟損傷作用及抗損傷活性化合物的篩選及評(píng)價(jià) 高尿酸可損傷血管和腎臟，促發(fā)心血管和腎臟疾病。實(shí)驗(yàn)建立大鼠高尿酸血癥模型，揭示高尿酸對(duì)血管和腎臟的病理作用及其作用機(jī)制；然后以尿酸生成的關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶為藥物作

4、用的分子靶點(diǎn)，建立黃嘌呤氧化酶抑制劑體外高通量篩選模型，利用此模型進(jìn)行樣品篩選；觀察篩選出的活性化合物對(duì)尿酸腎臟排泄影響；培養(yǎng)血管細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，觀察高尿酸對(duì)其病理作用，篩選出有較好保護(hù)作用的活性化合物，并探討其可能的作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)： 1.高尿酸血癥大鼠血清尿酸水平顯著增加，全身血壓輕度增加，其離體腸系膜血管床對(duì)各劑量KCl和NE收縮反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)各劑量SNP和Ach舒張反應(yīng)減弱，血清NO水平顯著減少，血漿vWF水平顯著

5、升高，T-NOS 活性顯著降低,iNOS活性顯著升高，腸系膜血管CRP、MCP-1蛋白表達(dá)顯著升高，eNOS蛋白表達(dá)降低；說明高尿酸對(duì)血管具有損傷作用，該損傷作用與血管NOS活性降低、CRP和MCP-1蛋白表達(dá)升高以及eNOS蛋白表達(dá)降低有關(guān)。 2.高尿酸血癥大鼠血清和腎組織肌酐、尿素氮、NAG和MDA含量顯著增加，T-NOS活性顯著降低、iNOS活性顯著升高，CRP、MCP-1蛋白表達(dá)顯著升高、eNOS蛋白表達(dá)降低；說明高尿酸

6、對(duì)腎臟具有損傷作用，該損傷作用與腎臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加、NOS活性降低、CRP、MCP-1蛋白表達(dá)顯著升高，eNOS蛋白表達(dá)降低有關(guān)。 3.應(yīng)用 XO 抑制劑高通量體外篩選模型篩選 71760 個(gè)樣品，發(fā)現(xiàn)27個(gè)具有較好活性的活性化合物，其中17個(gè)有較好量-效關(guān)系。 4.利用離體腎臟灌流模型評(píng)價(jià)篩選出的活性化合物對(duì)腎功能和腎臟尿酸排泄作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物J11222 (24.8ug/ml)和DF2956對(duì)腎臟具有損傷

7、作用；化合物J11222(8.27和2.48ug/ml)和J11225能增加尿酸排泄分?jǐn)?shù)和總尿酸排泄量，提示J11222和J11225具有促尿酸排泄作用。 5.FCS 1.5％和尿酸500μmol/L作用血管內(nèi)皮細(xì)胞48 h，能有效抑制其增殖；被篩選的30個(gè)中藥單體中姜黃素、三七皂苷R1和丹參酮Ⅰ在1-100 uM 內(nèi)對(duì)抗尿酸抑制的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，可促進(jìn)高尿酸處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞 NO 生成，抑制血管內(nèi)皮

8、細(xì)胞CRP、MCP-1表達(dá)、促進(jìn)eNOS蛋白表達(dá)。 6.尿酸500μmol/L作用血管平滑肌細(xì)胞48 h，能有效誘導(dǎo)其增殖；被篩選的30個(gè)中藥單體中丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、蘆丁、姜黃素、阿魏酸、三七皂苷R1、鹽酸川芎嗪能較好的抑制尿酸誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖率小于15％。 7.尿酸500μmol/L作用血管外膜成纖維細(xì)胞48 h，能有效誘導(dǎo)其增殖；被篩選的30個(gè)中藥單體中丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、姜黃素、阿魏酸、三七皂苷R1、鹽酸川

9、芎嗪有較好的抑制尿酸誘導(dǎo)細(xì)胞增殖作用，細(xì)胞增殖率小于15％。 8.尿酸500μmol/L作用人腎近曲小管細(xì)胞48 h，能有效誘導(dǎo)其增殖；被篩選的30個(gè)中藥單體中蘆丁、姜黃素、阿魏酸、人參皂苷。Rg1、三七皂苷R1、芍藥苷有較好的抑制尿酸誘導(dǎo)細(xì)胞增殖作用，細(xì)胞增殖率小于25％。 由上所得，高尿酸能引起血管和腎臟損傷；從抑制尿酸生成、促進(jìn)尿酸排泄和抗高尿酸血管和腎臟損傷方面篩選出了一些活性化合物，發(fā)現(xiàn)一些中藥單體通過改善NO生成，

10、提高NOS活性，改善CRP、MCP-1和eNOS蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗血管和腎臟損傷作用。 二、二甘醇對(duì)腎臟的損傷作用及抗損傷藥物的篩選和評(píng)價(jià) 二甘醇具有獨(dú)特的物理性能和化學(xué)性能，在工業(yè)和日用化學(xué)品方面用途十分廣泛，時(shí)常造成人中毒，而以腎毒性(急性腎功能衰竭)為主要表現(xiàn)。本研究以二甘醇的腎毒性為研究?jī)?nèi)容，觀察二甘醇對(duì)離體腎臟、小鼠、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎近曲小管細(xì)胞的毒性及藥物干預(yù)作用，為腎臟外源性物質(zhì)損傷研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃投蚀贾?/p>

11、毒的藥物干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1.發(fā)現(xiàn)二甘醇能增加離體腎臟灌流壓力、尿蛋白含量、尿量和腎臟MDA含量，對(duì)腎小球?yàn)V過率無影響，提示二甘醇能損傷腎臟血管和腎小管，該損傷與其誘發(fā)腎臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。 2.二甘醇中毒后，小鼠肝指數(shù)降低、腎指數(shù)增加，血液肌酐和尿素水平升高；肝臟和腎臟組織SOD和GSH-PX活性降低、MDA含量增加；大黃和澤瀉提取物具有一定的改善作用，該作用與改善抗氧化酶活性及抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。

12、 3.DEG 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有劑量和時(shí)間依賴性，DEG400μmol/L作用血管內(nèi)皮細(xì)胞 24 h，能明顯損傷細(xì)胞；被篩選的30個(gè)中藥單體中丹酚酸A，丹參酮ⅡA，，黃芪甲苷，金絲桃苷，槲皮素，人參皂苷Rb1能改善DEG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，保護(hù)率大于10％。 4.DEG對(duì)人腎近球小管細(xì)胞損傷具有劑量和時(shí)間依賴性，DEG400μmol/L作用腎近曲小管細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞造成明顯損傷；篩選的30個(gè)中藥單體中丹酚酸B