基于生物網絡調控下丹參抗腫瘤血管生成研究——丹酚酸B通過下調肝癌細胞AT1R蛋白的表達及VEGF的產生抑制肝癌血管生成.pdf

1、[背景和目的]
　　中藥研究的一個重點和難點問題就是理解中藥方劑復雜化學體系與病證發(fā)展生物系統(tǒng)的相互作用，闡明中藥方劑微因多效的分子機制。近些年從分子細胞水平探討中藥方劑多成分多靶點的作用也已經取得令人可喜的成績，為中藥方劑的研究奠定了堅實的基礎?；钛龇ㄊ侵嗅t(yī)治療腫瘤的大法，丹參作為活血化瘀藥的代表，在臨床主要用于心血管疾病的治療，另外在抗腫瘤治療中也是常用的中藥之一，治療肝癌的復方中幾乎都含有丹參。臨床上應用的多是丹參水提物

2、或者注射液，基于“單成分應用于多種疾病的”理論，在丹參水溶性成分中其物質作用基礎是什么？是否通過影響兩種疾病的共同因素發(fā)揮作用？
　　實驗室前期通過數據挖掘工具分析探究丹參有效成分抗腫瘤的相關靶點，發(fā)現血管緊張素Ⅱ1型受體AT1R(AngiotensinⅡtype1 receptor)在心血管疾病和腫瘤生長、轉移特別是腫瘤血管生成中都有重要的作用。因此，我們期望探究丹參水溶性成分是否通過影響腫瘤細胞AT1R干擾腫瘤血管生成，以進一

3、步闡明丹參多成分多靶點治療疾病的分子機制。
　　[實驗內容]
　　本文以惡性程度高、血管依賴性強的肝癌為病理模型剖析丹參水溶性成分是否通過調節(jié)肝癌細胞AT1R蛋白的表達影響肝癌血管生成。第一章考察了臨床肝癌樣本中AT1R與血管生成指標VEGF、MVD（微血管密度）的相關性。第二章從丹參水溶性成分中篩選能夠影響AngⅡ-AT1R軸的有效成分，利用小鼠海綿植入血管生成模型篩選了丹參4種水溶性成分，分別通過檢測海綿中血紅蛋白含量、

4、小鼠血清中VEGFA的濃度、HE染色血管計數及免疫組化計數初步篩選出有效成分。接著通過體內外實驗進一步確證篩選出的成分的作用和機制。第三章考察有效成分在肝癌血管生成中的作用，利用Western bloting和細胞免疫熒光技術篩選AT1R高表達的細胞株，MTS法考察有效成分對AngⅡ誘導下肝癌細胞增殖的影響，利用WB和ELISA法檢測有效成分對AngⅡ誘導下肝癌細胞AT1R蛋白表達及細胞上清中VEGFA濃度的影響，最后考察有效成分對肝癌

5、裸鼠移植瘤瘤體積和血管生成的影響。
　　[研究結果]
　　第一章通過免疫組化檢測40例肝癌樣本，發(fā)現肝癌組織中AT1R的表達與VEGF的表達、MVD均呈正相關，表明在肝癌血管生成中AT1R是一個重要的因素。第二章通過海綿植入模型的篩選及海綿中血紅蛋白、小鼠血清VEGFA的濃度檢測、海綿切片血管計數等方法，我們發(fā)現在4種水溶性成分中丹酚酸B2mg/Kg能夠有效地抑制AngⅡ誘導的血管生成，免疫組化結果顯示丹酚酸B能夠下調血管內

6、皮AT1R蛋白的表達及VEGFA的產生。為進一步證實丹酚酸B的作用，結果表明丹酚酸B對AngⅡ誘導的原代臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的增殖沒有顯著影響，但能夠有效抑制AngⅡ誘導的HUVEC的遷移和管腔形成。WB實驗表明，丹酚酸B能夠劑量依賴性地下調AngⅡ誘導的HUVEC中AT1R蛋白表達，ELISA實驗表明，丹酚酸B能夠劑量依賴性的減少細胞上清中VEGFA的濃度。利用斑馬魚血管生成模型進一步證實丹酚酸B的整體作用，實驗表明丹酚酸B能

7、夠有效抑制AngⅡ誘導的斑馬魚血管生成。第三章首先通過篩選肝癌細胞中AT1R高表達的細胞株，確定了表達程度最高的2株:SMMC7721和HepG2，丹酚酸B對2株肝癌細胞的增殖及AngⅡ刺激下的增殖均無顯著的影響，但能夠劑量依賴性的下調肝癌細胞AT1R的表達及細胞上清中VEGFA的含量，最后通過SMMC7721裸鼠移植瘤實驗發(fā)現丹酚酸B能夠有效的抑制肝癌移植瘤的生長，但體外實驗證實其對肝癌細胞的增殖沒有顯著的影響，那么是否是通過影響血管

8、生成的結果昵？通過免疫組化實驗證實丹酚酸B能夠劑量依賴性的下調移植瘤中AT1R蛋白的表達及VEGFA的表達，同時減少肝癌組織中CD34的表達。
　　[結論和意義]
　　實驗結果表明丹參水溶性成分中丹酚酸B通過下調血管內皮細胞中AT1R蛋白的表達，減少血管內皮細胞VEGF的自分泌，從而抑制AngⅡ誘導的內皮細胞的遷移和管腔形成。在肝癌中，丹酚酸B通過下調肝癌細胞的AT1R的表達，減少肝癌細胞的VEGF的分泌，從而影響VEGF以