聚乙二醇-聚酯-聚甲基丙烯酸二甲氨酸乙酯三嵌段共聚物納米?；蜉d體的研究.pdf

1、基因治療作為一種全新的疾病治療手段，為惡性腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及病毒性流行病等臨床治療難題提供了新的解決途徑。安全、高效的基因傳遞系統(tǒng)是基因治療成功應(yīng)用的重要因素之一，是基因治療研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率比較高，但安全性、免疫原性等缺點(diǎn)限制了其作為基因載體的應(yīng)用。非病毒載體以其具有的安全性高、免疫原性低、易修飾等優(yōu)點(diǎn)吸引了眾多研究者的目光，但其遞送基因的轉(zhuǎn)染效率有待提高。本文基于聚乙二醇、聚甲基丙烯酸二

2、甲氨基乙酯(PDMAEMA)和生物降解性較好的聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PDLLA)，構(gòu)建了兩種生物可降解的非病毒基因載體，并對(duì)它們的基因遞送性能進(jìn)行了研究。
　　 本文首先通過開環(huán)聚合(ROP)和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)相結(jié)合的方法合成了生物可降解的兩親性三嵌段聚合物mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA，研究了其自組裝納米粒共負(fù)載疏水性藥物紫杉醇和核酸的功能性。mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA可以在水中自組

3、裝形成以疏水性的PCL為內(nèi)核，親水性的PEG和PDMAEMA為外殼，平均粒徑為150納米左右的核殼結(jié)構(gòu)納米粒。mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA具有明顯的pH敏感性，載紫杉醇的納米粒在酸性條件下(pH=5.0)的藥物釋放速率明顯高于中性條件(pH=7.2)。聚合物納米?？赏瑫r(shí)負(fù)載紫杉醇和pDNA，形成的NPs/pDNA復(fù)合物粒徑保持在200納米左右且粒子表面呈正電性。當(dāng)N/P比大于等于3時(shí)，mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA

4、納米?？蓪NA完全阻滯，且紫杉醇的負(fù)載不影響mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA納米粒對(duì)DNA的結(jié)合能力及基因轉(zhuǎn)染效率。N/P比對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大的影響，此外5％的血清存在并不抑制mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA納米粒在293T細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率，相反在一定程度上促進(jìn)了蛋白的表達(dá)，可見，納米粒在血清中有很好的穩(wěn)定性。激光共聚焦熒光顯微鏡研究結(jié)果表明mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA納米粒能夠有效的被細(xì)胞內(nèi)吞，且表現(xiàn)出很強(qiáng)

5、的溶酶體逃脫能力；小鼠體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)表明其納米粒主要分布在胰臟、腎和脾等部位，且具有很好的腫瘤靶向效應(yīng)。上述研究結(jié)果表明mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA納米粒在藥物和核酸共遞送方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但由于PCL結(jié)晶度高、疏水性強(qiáng)、降解速度慢，因而只適于作為長效藥物/基因載體。
　　 為了克服PCL結(jié)晶度高、疏水性強(qiáng)、降解速度慢的問題，我們采用了生物降解性和生物相容性較好的PDLLA作為疏水段，構(gòu)建基因載體。通過ROP和AT

6、RP合成了mPEG-b-PDLLA-b-PDMAEMA，該聚合物具有較低的CAC，可在水中自組裝形成粒徑在100 nm左右，表面電位為5～6 mV的核殼型納米粒。形成的納米?？捎行饪spDNA，且具有很好的抗牛血清蛋白(BSA)吸附性。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，mPEG-b-PDLLA-b-PDMAEMA NPs在HeLa細(xì)胞上有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，且轉(zhuǎn)染效率受N/P比和載體中陽離子段長度的影響。值得注意的是納米粒載體的最佳轉(zhuǎn)染效率與商品化試劑

7、Lipofectamine2000相差無幾，加入10％血清后納米粒載體仍具有與Lipofectamine2000相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染效率。MTT結(jié)果顯示mPEG-b-PDLLA-b-PDMAEMA NPs具有較低的細(xì)胞毒性，因此生物相容性較好。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)表明mPEG-b-PDLLA-b-PDMAEMA NPs能夠有效負(fù)載pDNA進(jìn)入細(xì)胞，且具有很強(qiáng)的溶酶體逃脫能力。因此mPEG-b-PDLLA-b-PDMAEMA NPs作為基因載體具有潛在的

8、應(yīng)用價(jià)值。
　　 本文最后一部分工作探討了疏水段結(jié)構(gòu)及長度對(duì)納米載體在基因傳遞中的作用和影響。首先我們制備了一系列具有不同疏水段長度的mPEG-b-PCL-b-PDMAEMA(PECLD)和mPEG-b-PDLLA-b-PDMAEMA(PEDLD)可降解三嵌段共聚物，制備的PECLD和PEDLD系列聚合物均具有極低的臨界聚集濃度(CAC)，疏水段分子量大小對(duì)聚合物CAC的影響比較明顯，疏水段相對(duì)分子量越大，聚合物的CAC值越小。

9、對(duì)于不同疏水段而言，當(dāng)疏水段聚合度相同時(shí)，PECLD聚合物的CAC值均小于PEDLD聚合物。隨著聚合物中疏水段相對(duì)分子量的增加，PECLD和PEDLD NPs及NPs/pDNA復(fù)合物的粒徑和zeta電位均逐漸增大。相比之下，PEDLD NPs及NPs/pDNA復(fù)合物的粒徑和zeta電位均大于PECLD NPs及NPs/pDNA復(fù)合物。疏水段鏈長的變化并不會(huì)降低載體對(duì)DNA的結(jié)合能力，但疏水段種類、長度對(duì)轉(zhuǎn)染效率有影響。隨著聚合物中可降解