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文檔簡介
1、一.研究背景: 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一,其病理為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性及死亡,并伴有殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易氏小體。大量證據(jù)表明,凋亡是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡的主要機制,而且線粒體氧化應(yīng)激是凋亡的關(guān)鍵。 魚藤酮作為線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑,能夠增加活性氧的生成及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的消耗,導(dǎo)致氧化損傷,進(jìn)而增加線粒體通透性,引起線粒體膜電位的去極化,誘導(dǎo)凋亡。分化
2、PC12細(xì)胞具有典型的多巴胺能特征。因此,魚藤酮誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞模型可作為研究PD線粒體氧化應(yīng)激機制的很好模型。 PD仍是以內(nèi)科治療為主,盡管許多藥物如左旋多巴能有效緩解PD癥狀,但是長期使用這些藥物常常會出現(xiàn)嚴(yán)重副作用,這些藥物無法阻止疾病的進(jìn)展。因此,很有必要尋找有效且副作用少,能阻止或逆轉(zhuǎn)該疾病的藥物。利福平作為利福霉素的半合成衍生物,臨床應(yīng)用已有40余年歷史,具有良好的安全性,研究表明其除有殺菌作用外,尚具抗凋亡
3、和神經(jīng)保護作用。我們的前期實驗也證實了這一神經(jīng)保護作用。然而,利福平介導(dǎo)這一作用的具體機制尚不明確。有研究表明,利福平可能作為自由基清除劑起神經(jīng)保護作用。且迄今為止,尚未見體外魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞模型上研究線粒體氧化應(yīng)激與利福平神經(jīng)保護作用相關(guān)性的報道。 基于上述的理論基礎(chǔ)和研究背景,本研究選擇魚藤酮誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞構(gòu)建線粒體氧化應(yīng)激的PD細(xì)胞模型,進(jìn)一步探討和研究利福平神經(jīng)保護和抗細(xì)胞凋亡的相關(guān)機制。 二.研究目的:
4、 1.魚藤酮誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞構(gòu)建線粒體氧化應(yīng)激的PD細(xì)胞模型。 2.探討利福平對魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧及谷胱甘肽的影響。 3.明確利福平對魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型的保護作用。 4.探討利福平的神經(jīng)保護作用機制,為其用于PD的臨床治療提供依據(jù)。 三.實驗對象和方法: 1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組:PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株細(xì)胞)經(jīng)100ng/ml7S神經(jīng)生長因子處理9天成
5、分化細(xì)胞后培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12中,并孵育在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中。隔天更換培養(yǎng)基。根據(jù)不同的處理條件分成六組:對照組(常規(guī)加培養(yǎng)基)、利福平組(300μmol/L利福平作用26h)、魚藤酮組(2.5μmol/L魚藤酮作用24h)和三組利福平預(yù)處理組(先分別給予100,200 and300μmol/L利福平預(yù)處理2h,然后2.5μmol/L魚藤酮再作用24h)。 2.檢測方法:(1) MTT法檢測細(xì)胞
6、活性;(2) Hoechst33342核染和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;(3)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測量經(jīng)羅丹明123標(biāo)記的線粒體膜電位;(4)流式細(xì)胞儀分析DCFH—DA標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)活性氧生成;(5)酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽。 3.統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,采用單因素方差分析,處理組間的兩兩比較用LSD—t檢驗,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 四.實驗結(jié)果: 2.5μmo
7、l/L魚藤酮作用24h能增加分化PC12細(xì)胞凋亡同時促進(jìn)細(xì)胞線粒體膜電位去極化、增加活性氧生成及谷胱甘肽耗竭;當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過100,200 and300μmol/L利福平預(yù)處理2h后,魚藤酮誘導(dǎo)的這一線粒體功能障礙能夠被利福平以劑量依賴的方式阻斷。 五.實驗結(jié)論: 1.利福平能降低魚藤酮誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞線粒體膜電位去極化、活性氧含量生成及還原型谷胱甘肽的消耗。 2.利福平能抑制魚藤酮誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞凋亡。
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