MUC1模擬表位肽疫苗預(yù)防和治療膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察MUC1糖鏈和肽鏈表位在腎臟和膀胱腫瘤中的表達(dá)，篩選MUC1糖鏈表位的模擬肽，研究模擬表位肽疫苗誘導(dǎo)T739小鼠產(chǎn)生功能性免疫應(yīng)答及預(yù)防和治療膀胱癌的作用。 材料與方法：1)免疫組化二步法檢測(cè)MUC1糖鏈和肽表位在腎癌及膀胱癌中的表達(dá)、分布及其與細(xì)胞類(lèi)型、腫瘤分期分級(jí)的關(guān)系；2)篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)，獲得與識(shí)別MUC1糖鏈表位的單克隆抗體Ma695結(jié)合的模擬肽；流式細(xì)胞儀鑒定模擬肽的競(jìng)爭(zhēng)抑制效應(yīng)；分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)

2、胞，在GM-CSF和IL-4條件下培養(yǎng)獲得樹(shù)突狀細(xì)胞，LPS促其成熟，F(xiàn)CM鑒定其純度；負(fù)載模擬肽的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞免疫T739小鼠后，用ELISA、ELISPOT等方法觀察模擬肽誘導(dǎo)與原表位交叉反應(yīng)的體液免疫應(yīng)答和特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答；非放射性乳酸脫氫酶法檢測(cè)體外細(xì)胞毒活性；3)利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，在BST739中轉(zhuǎn)入人MUC1全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)G418篩選和克隆化培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)MUC1的T739小鼠膀胱癌細(xì)胞亞系BST739-MUC

3、1，PCR、RT-PCR、免疫組化、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡等鑒定MUC1基因和蛋白的表達(dá)及分布，觀察轉(zhuǎn)入人MUC1對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附和體內(nèi)外生長(zhǎng)的影響；4)建立小鼠膀胱移行細(xì)胞癌預(yù)防和治療模型，觀察模擬表位肽疫苗的預(yù)防和治療作用。結(jié)果：1)MUC1在85.5％的腎臟腫瘤和100％的移行細(xì)胞癌中表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及分布模式與腫瘤分期分級(jí)相關(guān)。2)篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)獲得MUC1糖鏈表位的模擬表位肽M1，能競(jìng)爭(zhēng)抑制Ma695與MUC

4、1+腫瘤細(xì)胞MCF7的結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞數(shù)為2×105、Ma695濃度為0.25μg/ml、Ml肽濃度為100、200、400、800μg/ml時(shí)，抑制率分別為11％、26％、26％和34％；脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7天獲得具有典型形態(tài)特征的樹(shù)突狀細(xì)胞，F(xiàn)CM顯示其純度為83.2％；負(fù)載M1肽的DC免疫小鼠后，誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答，ELISPOT結(jié)果表明，活化的特異性T細(xì)胞為脾臟淋巴細(xì)胞的116/105；同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生M1肽特異性抗體，能與MUC1+

5、腫瘤細(xì)胞結(jié)合，但不與MUC1-細(xì)胞結(jié)合；3)基因組PCR、RT-PCR、免疫組化和免疫印跡從DNA、mRNA和蛋白質(zhì)水平證實(shí)外源基因整合在細(xì)胞基因組中并穩(wěn)定表達(dá)MUC1，激光共聚焦顯微鏡顯示MUC1彌漫分布于胞膜和胞漿；與親代細(xì)胞相比，BST739-MUC1體外黏附力增加44％，體外生長(zhǎng)特性無(wú)明顯改變，但在同系小鼠體內(nèi)腫瘤早期生長(zhǎng)較快，第18天時(shí)腫瘤平均體積為2744±948mm3(vs808±322mm3，p=0.0013)；從第18

6、天開(kāi)始，腫瘤生長(zhǎng)速度減慢；小鼠可自發(fā)排斥表達(dá)人MUC1的BST739-MUC1細(xì)胞。4)負(fù)載M1肽的DC免疫后，效靶比為100：1時(shí)，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞能溶破18.9％～29.5％的BST739-MUC1，具有一定的抗腫瘤活性；預(yù)防模型中，M1肽能延緩腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤重量?jī)H為對(duì)照組的14.4％(1.7±0.8mgvs11.8±4.8mg)；小鼠血清M1肽特異性抗體濃度升高167％(1.52±0.54vs0.57±0.21)，CTL活性升高1

7、22％(17.3％vs7.8％)；治療模型中，M1肽能使小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)50％(44±5.7天vs30±1.6天，p=0.0031)，抗體濃度升高338％(1.71vs0.39)，CTL活性升高71％(19.5％vs11.4％)。結(jié)論：1).MUC1異常表達(dá)在腎癌和膀胱癌中十分常見(jiàn)，與腫瘤分期、分級(jí)和細(xì)胞類(lèi)型有良好的相關(guān)性，是RCC和TCC免疫治療的靶標(biāo)之一。2).建立穩(wěn)定表達(dá)人MUC1的小鼠膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系及相關(guān)腫瘤模型；3).篩