MiR-210在缺氧、氰化物暴露所致PC12細(xì)胞損傷效應(yīng)中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　缺氧環(huán)境會(huì)影響機(jī)體的正常生理過程,降低人員腦力和體力作業(yè)能力,甚至誘發(fā)急性高原腦水腫和肺水腫、心腦血管缺血性損傷等多種缺氧相關(guān)疾病。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的耗氧量最大,表現(xiàn)出對(duì)缺氧十分敏感。神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于線粒體的依賴使線粒體障礙成為造成神經(jīng)系統(tǒng)異常的重要因素。研究表明,缺氧能夠影響多種miRNA表達(dá),其中以miR-210的高水平表達(dá)穩(wěn)定且顯著。與線粒體密切相關(guān)的ISCU1/2和COX10蛋白正是miR-210的靶基因。本研

2、究以原始神經(jīng)細(xì)胞系PC12細(xì)胞、16HBE支氣管上皮細(xì)胞、HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為缺氧模型,比較缺氧對(duì)不同來源組織細(xì)胞作用的差異,重點(diǎn)觀察缺氧、氰化物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活的影響及其可能機(jī)制,研究miR-210在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)、調(diào)控細(xì)胞應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外缺氧的相關(guān)機(jī)制以及對(duì)線粒體功能的影響。
　　研究內(nèi)容:
　　PC12細(xì)胞、16HBE細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞進(jìn)行1％O2缺氧暴露,實(shí)驗(yàn)組分為缺氧12h組、缺氧24h組、缺氧48h

3、組。觀察缺氧暴露對(duì)于PC12細(xì)胞、16HBE細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞形態(tài)的改變。利用CCK-8法檢測缺氧暴露后細(xì)胞存活率的變化。采用qRT-PCR方法檢測miR-210在缺氧暴露后的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。采用miR-210mimic和miR-210 inhibitor轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,驗(yàn)證在缺氧情況下miR-210對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　利用流式細(xì)胞儀測定缺氧暴露后PC12細(xì)胞線粒體膜電位的變化。高效液相色譜法(HPLC)測定缺氧暴露后P

4、C12細(xì)胞中ATP、ADP和AMP的含量,反映缺氧后線粒體功能的改變。用Western blot測定PC12細(xì)胞缺氧暴露后線粒體相關(guān)蛋白ISCU和COX10的表達(dá)情況,反映缺氧對(duì)線粒體呼吸鏈的影響。
　　氰化鈉染毒PC12細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)改變并且利用MTT法檢測細(xì)胞毒性。采用qRT-PCR方法檢測miR-210在氰化鈉染毒后表達(dá)的變化。用Western blot測定PC12細(xì)胞線粒體相關(guān)蛋白ISCU和COX10的表達(dá)情況,比較細(xì)

5、胞內(nèi)缺氧與環(huán)境缺氧的區(qū)別。
　　研究結(jié)果:
　　缺氧暴露不同程度地降低了PC12細(xì)胞、16HBE細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞存活率,其中缺氧24h組和48h組的細(xì)胞存活率顯著低于正常對(duì)照組。PC12細(xì)胞缺氧暴露12小時(shí)后,胞體腫脹;缺氧暴露24小時(shí)后,PC12細(xì)胞密度降低,折光性下降,細(xì)胞突觸變短和減少,由多角形細(xì)胞為主向雙極細(xì)胞為主轉(zhuǎn)變。16HBE細(xì)胞缺氧暴露24小時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)固縮,細(xì)胞密度降低。HUVEC細(xì)胞缺氧暴露24小時(shí)后,細(xì)

6、胞密度降低,邊界模糊,折光率下降。在缺氧暴露48小時(shí)后三種細(xì)胞死亡數(shù)量明顯增多。
　　利用Rhodamine123和高效液相色譜法的檢測結(jié)果表現(xiàn)出PC12細(xì)胞缺氧組較對(duì)照組線粒體膜電位下降,線粒體內(nèi)ATP含量顯著降低,而ADP、AMP含量顯著升高,提示線粒體呼吸調(diào)節(jié)功能、氧化磷酸化偶聯(lián)在缺氧作用下發(fā)生了嚴(yán)重障礙,線粒體內(nèi)膜的ATP合酶復(fù)合體受到抑制,導(dǎo)致了ATP合成效率降低,進(jìn)一步加劇了線粒體ATP含量的下降。
　　用qRT

7、-PCR方法檢測出缺氧暴露后miR-210的表達(dá)顯著升高,16HBE細(xì)胞反應(yīng)早而強(qiáng)烈(12h開始即達(dá)最強(qiáng)水平),PC12細(xì)胞反應(yīng)逐漸加強(qiáng)(48h達(dá)到最強(qiáng)水平),HUVEC細(xì)胞中等程度升高(12-24h)。Western blot結(jié)果提示ISCU和COX10作為miR-210的靶基因,其表達(dá)顯著降低,與缺氧暴露存在著時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。
　　在PC12細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-210后,miR-210mimic24h組和48h組存活率顯

8、著增加,而miR-210 inhibitor各組存活率均顯著下降,表明在缺氧情況下miR-210對(duì)于PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　氰化鈉染毒PC12細(xì)胞氰化鈉濃度為1mM時(shí)miR-210顯著升高。MiR-210靶基因ISCU1/2和COX10蛋白的表達(dá)相應(yīng)降低,結(jié)果顯示出細(xì)胞內(nèi)缺氧與環(huán)境缺氧的一致性。
　　研究結(jié)論:
　　根據(jù)以上研究結(jié)果,得出結(jié)論如下:
　　本研究首次比較了缺氧誘導(dǎo)不同組織來源細(xì)胞表達(dá)miR-

9、210的作用特點(diǎn),呼吸道上皮細(xì)胞反應(yīng)早而強(qiáng)烈(12h開始即達(dá)最強(qiáng)水平),神經(jīng)組織細(xì)胞反應(yīng)逐漸加強(qiáng)(48h達(dá)到最強(qiáng)水平),血管內(nèi)皮細(xì)胞中等程度升高(12-24h)。
　　缺氧環(huán)境能顯著抑制PC12細(xì)胞、16HBE細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞增殖,缺氧誘導(dǎo)的miR-210表達(dá)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　缺氧導(dǎo)致PC12細(xì)胞線粒體功能嚴(yán)重障礙,降低線粒體膜電位,影響線粒體ATP合成率。
　　缺氧誘導(dǎo)的miR-210通過調(diào)控其靶基因