槐杞黃浸膏通過(guò)smad2依賴的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1途徑抑制大鼠系膜細(xì)胞增殖及CTGF合成.pdf

1、目的:腎小球系膜細(xì)胞在維護(hù)腎小球結(jié)構(gòu)完整和功能調(diào)節(jié)等方面起到關(guān)鍵作用,其增生失控及相應(yīng)結(jié)構(gòu)重塑是導(dǎo)致腎小球硬化的重要機(jī)制,TGFβ1導(dǎo)致胞外基質(zhì)集聚及纖維化,CTGF是TGF-β1致纖維化的重要的下游介質(zhì)。本研究構(gòu)建TGF-β1系膜細(xì)胞增殖模型，觀察槐杞黃對(duì)TGF-β1介導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期時(shí)相以及CTGF表達(dá)水平的影響，并探討Smad和ERK信號(hào)通路在其中的作用。
　　 方法:1.培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞，不同濃度的槐杞黃（0n

2、g/ml，6ng/ml，12ng/ml，18ng/ml）預(yù)孵育12h，加2ng/mlTGFβ1繼續(xù)作用24h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。2.在培養(yǎng)的系膜細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入不同濃度的槐杞黃（0ng/ml，6ng/ml，12ng/ml，18ng/ml）預(yù)孵育12h,與此基礎(chǔ)上2ng/mlTGFβ1作用24h,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。3.以2ng/ml TGFβ1刺激系膜細(xì)胞（0，1，2，3，6，9，12，24，48h），Westernblo

3、t動(dòng)態(tài)觀察CTGF蛋白表達(dá)。4.不同濃度的槐杞黃（0ng/ml，6ng/ml，12ng/ml，18ng/ml）與系膜細(xì)胞預(yù)孵育12h,加2ng/mlTGFβ1 作用2h，觀察不同濃度的槐杞黃對(duì)CTGF表達(dá)的影響。5.觀察TGFβ1誘導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路蛋白磷酸化以及核轉(zhuǎn)位情況，探討槐杞黃抑制CTGF表達(dá)的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示：槐杞黃6ng/ml時(shí)候即可顯示20％細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，其后濃度越高，抑制效應(yīng)越強(qiáng)，在18n

4、g/ml時(shí)候達(dá)到60％。提示槐杞黃以濃度依賴的方式抑制系膜細(xì)胞的增殖（P<0.05)。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比,槐杞黃處理細(xì)胞后，GO/G1期細(xì)胞的比例上升，而S期和G2/M期細(xì)胞相應(yīng)減少，差異具有顯著性（P<0.05)，提示細(xì)胞停滯在GO/G1期，并且隨著濃度的增高，細(xì)胞阻滯在GO/G1期的比例增多。3.Westernblot顯示在TGF-β1作用系膜細(xì)胞1h即見(jiàn)CTGF蛋白表達(dá)增強(qiáng),2h達(dá)到峰值，而槐杞黃以濃度依賴方式抑

5、制CTGF表達(dá)。4.TGF-1作用系膜細(xì)胞1h即見(jiàn)Smad2磷酸化，且表達(dá)水平維持6h后逐漸下降；槐杞黃預(yù)處理細(xì)胞12h,可以部分阻斷TGF-1 誘導(dǎo)的Smad2磷酸化。5.TGF-1可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞ERK1/2磷酸化，2h時(shí)ERK1/2磷酸化水平達(dá)到高峰，以后逐漸下降，而總ERK1/2蛋白水平比較穩(wěn)定；槐杞黃不影響TGF-1誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化水平。6.TGF-1作用2h后，系膜細(xì)胞胞核中的磷酸化Smad2、總Smad2/3、Sma