TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞IV型膠原表達(dá)過(guò)程中MAPK和Smad2通路之間的串話.pdf

1、前言：
　　腎小球硬化是腎小球腎炎和其他腎臟疾病發(fā)展過(guò)程中的一種常見(jiàn)病理改變,其主要病理特征是腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)過(guò)度沉積。而腎臟系膜細(xì)胞(mesangial cell,MC)是目前公認(rèn)的分泌腎小球ECM的主要細(xì)胞,在維持腎小球結(jié)構(gòu)和功能完整性方面都發(fā)揮重要作用。Ⅳ型膠原(type Ⅳ collagen,collagen Ⅳ)是腎小球ECM的重要成分之一,特別是發(fā)生腎小球腎炎和腎小

2、球硬化時(shí),在MC能夠影響到的系膜區(qū)和基底膜部位,Ⅳ型膠原的含量明顯增多。因此,研究腎小球MC中Ⅳ型膠原的表達(dá)及其影響機(jī)制,對(duì)于認(rèn)識(shí)和調(diào)控腎小球硬化具有重要意義。
　　MC可自分泌多種細(xì)胞因子,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor β1,TGF-β1)就是其中的一種,TGF-β1是TGF-β超家族的成員,上調(diào)ECM基因表達(dá)、促進(jìn)ECM沉積是其重要功能之一。因此,TGF-β1在腎小球硬化過(guò)程中發(fā)揮重要

3、作用。TGF-β1主要靠其下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)發(fā)揮作用,Smads家族是TGF-β1下游經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)分子。除此之外,還存在其他一些非Smad通路,如MAPK通路、AKT/PI3K通路等。MAPK信號(hào)通路是目前已證實(shí)的TGF-β1下游重要的非Smad信號(hào)通路之一,而且大量報(bào)道顯示,TGF-β1/Smad和MAPK通路之間存在串話,其中以ERK1/2與Smad之間的關(guān)系研究最多,JNK、p38與Smad通路之間的關(guān)系研究相對(duì)較少。

4、　　飾膠蛋白聚糖(Decorin,DCN)是一種富含亮氨酸的小分子量蛋白聚糖,也是MC分泌的重要成分之一,主要分布在結(jié)締組織中,屬于ECM成分的一種。在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、ECM合成沉積、細(xì)胞因子功能等方面發(fā)揮重要作用。DCN可以通過(guò)多種機(jī)制拮抗TGF-β1的生物學(xué)功能,因此,DCN是TGF-β1重要的抑制因子。我們實(shí)驗(yàn)室前期工作已證實(shí),DCN可以抑制大鼠腎臟MC生長(zhǎng)和基質(zhì)合成,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,DCN可拮抗大鼠抗Thy-1.1腎炎模型病變腎小

5、球的程度和發(fā)展。但其在腎小球病變中的作用機(jī)制目前還沒(méi)有完全闡明。
　　在腎小球硬化中,TGF-β1主要作用于腎臟MC。研究表明,腎小球病變時(shí)TGF-β1在激活Smad信號(hào)通路過(guò)程中,也有MAPK通路信號(hào)分子被激活。但MC中MAPK-Smad信號(hào)分子之間的串話作用研究還是較少的。Hayashida等曾證明人的MC中,ERK1/2依賴的Smad3連接區(qū)磷酸化能夠促進(jìn)Ⅰ型膠原的表達(dá),但ERK1/2和Smad通路之間相互影響的復(fù)雜機(jī)制還是

6、沒(méi)有完全了解。因此,本實(shí)驗(yàn)中我們?cè)隗w外培養(yǎng)的大鼠MC中繼續(xù)深入研究MAPK和Smad通路之間的串話作用,特別是除ERK12分子外,JNK及p38與Smad2之間的串話,以及這些串話在MCTGF-β1誘導(dǎo)的Ⅳ型膠原表達(dá)過(guò)程中的作用。同時(shí),初步探討DCN對(duì)Ⅳ型膠原表達(dá)的影響,及其對(duì)TGF-β1活化的MAPK和Smad通路的作用,為后續(xù)研究的展開(kāi)做好鋪墊。
　　第一部分TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原表達(dá)過(guò)程中MAPK對(duì)Smad2

7、通路的影響
　　目的：探討外源性TGF-β1對(duì)體外培養(yǎng)大鼠MC表達(dá)Ⅳ型膠原以及對(duì)MAPKs和Smad2信號(hào)通路的影響,同時(shí)觀察該過(guò)程中MAPK對(duì)Smad2信號(hào)通路的影響。
　　方法：培養(yǎng)大鼠MC,在培養(yǎng)液中添加外源性TGF-β1,采用Western Blot方法觀察MC內(nèi)Ⅳ型膠原和MAPKs表達(dá)的變化;或者通過(guò)預(yù)先在培養(yǎng)液中分別添加MAPK信號(hào)通路抑制劑U0126、SB203580、SP600125,再用外源性TGF-β1因

8、子刺激,采用Western Blot方法觀察MC內(nèi)Ⅳ型膠原以及MAPKs和Smad2表達(dá)的變化,同時(shí)采用Realtime RT-PCR檢測(cè)不同處理后,Ⅳ型膠原mRNA水平的改變。
　　結(jié)果：用不同濃度的TGF-β1刺激MC6h,可見(jiàn)Ⅳ型膠原從1ng/ml開(kāi)始有上升趨勢(shì),其中以2.5ng/ml升高最明顯(P＜0.05)。然后以2.5ng/ml的TGF-β1,以不同的作用時(shí)間(0-6h)刺激MC,可見(jiàn)Ⅳ型膠原表達(dá)在TGF-β1作用后3

9、0min時(shí)即開(kāi)始升高,6h升高最明顯(P＜0.05),表明外源性TGF-β1誘導(dǎo)的MC內(nèi)Ⅳ型膠原表達(dá)升高呈劑量和時(shí)間依賴性。與此同時(shí),TGF-β1激活了MAPKs和Smad信號(hào)通路,TGF-β1作用15min后可見(jiàn)磷酸化的ERK、JNK、p38和Smad2均表達(dá)升高,其中磷酸化的ERK、p38和Smad2在TGF-β1作用后1h達(dá)高峰,磷酸化的JNK在2h達(dá)高峰(P＜0.05),然后逐漸下降。
　　使用ERK、JNK、p38通路抑

10、制劑后,TGF-β1誘導(dǎo)的ERK、JNK和p38的磷酸化水平都有下降(P＜0.05)。同時(shí),使用ERK、p38通路抑制劑后,TGF-β1誘導(dǎo)的P-Smad2C末端(P-Smad2C)和P-Smad2連接區(qū)(P-Smad2L)也下調(diào)(P＜0.05),但使用JNK通路抑制劑后,僅P-Smad2C下調(diào)(P＜0.05),對(duì)P-Smad2L無(wú)明顯作用(P＞0.05)。
　　使用ERK、JNK、p38通路抑制劑后,再用外源性TGF-β1因子刺

11、激,TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅳ型膠原蛋白和mRNA水平均下調(diào)(P＜0.05)。
　　小結(jié)：外源性TGF-β1誘導(dǎo)的MC內(nèi)Ⅳ型膠原表達(dá)升高呈劑量和時(shí)間依賴性;TGF-β1活化的MAPKs和Smad信號(hào)通路,參與了TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅳ型膠原表達(dá)過(guò)程的調(diào)控。ERK1/2、p38和JNK通路與Smad2通路之間存在串話,但ERK1/2,p38與Smd2通路之間的串話和JNK與Smad2通路之間的串話又存在差異。
　　第二部分TGF-β1誘

12、導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原表達(dá)過(guò)程中Smad2對(duì)MAPK通路的影響
　　目的：探討Dominant Negative Smad2(DN-Smad2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅳ型膠原表達(dá)的影響,同時(shí)探討Smad2對(duì)MAPK通路的影響。
　　方法：培養(yǎng)MC,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DN-Smad2質(zhì)粒后,再用外源性TGF-β1因子刺激,采用Western Blot方法觀察MC內(nèi)Ⅳ型膠原以及MAPKs和Smad2表達(dá)的變化,同時(shí)采用Rea

13、ltime RT-PCR檢測(cè)不同處理后,Ⅳ型膠原mRNA水平的改變。
　　結(jié)果：DN-Smad2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,再用外源性TGF-β1因子刺激,TGF-β1誘導(dǎo)的P-Smad2和Ⅳ型膠原表達(dá)水平下降(P＜0.05)。同時(shí),在DN-Smad2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,無(wú)外源性TGF-β1刺激的MC中基礎(chǔ)狀態(tài)和加TGF-β1誘導(dǎo)的P-ERK、P-JNK表達(dá)均下調(diào)(P＜0.05),但對(duì)P-p38的表達(dá)無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　小結(jié)：Smad

14、信號(hào)通路本身參與了TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅳ型膠原表達(dá)過(guò)程的調(diào)控。同時(shí),Smad2表達(dá)下調(diào)也能影響P-ERK、P-JNK的表達(dá),推測(cè)Smad2還可能通過(guò)影響MAPK通路間接影響Ⅳ型膠原的表達(dá)。
　　第三部分飾膠蛋白聚糖對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅳ型膠原表達(dá)及MAPK和Smad2通路的影響
　　目的：初步探討飾膠蛋白聚糖(DCN)在Ⅳ型膠原表達(dá)過(guò)程中的作用及其對(duì)TGF-β1活化的MAPKs和Smad2信號(hào)通路的影響。
　　方法：培養(yǎng)

15、MC,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DCN至MC內(nèi)或用RNA干擾技術(shù)干擾MC內(nèi)DCN基因表達(dá),再用或不用外源性TGF-β1刺激,觀察MC內(nèi)Ⅳ型膠原表達(dá)以及MAPKs和Smad2通路的變化情況。
　　結(jié)果：DCN轉(zhuǎn)染后,與正常對(duì)照相比,MC內(nèi)DCN蛋白和mRNA水平升高(P＜0.05);同時(shí),MC內(nèi)Ⅳ型膠原蛋白和mRNA水平降低(P＜0.05);DCN轉(zhuǎn)染后再用TGF-β1刺激,TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅳ型膠原表達(dá)降低(P＜0.05)。相反,

16、DCN干擾后,與正常對(duì)照組相比,MC中DCN蛋白和mRNA水平下降(P＜0.05);而Ⅳ型膠原表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.05);DCN干擾后再用TGF-β1刺激,Ⅳ型膠原的表達(dá)高于單純TGF-β1刺激組(P＜0.05)。
　　DCN轉(zhuǎn)染后,再用TGF-β1刺激,TGF-β1誘導(dǎo)的P-ERK1/2、P-JNK、P-p38和P-Smad2的表達(dá)量均降低;DCN干擾后,再用TGF-β1刺激,與單純TGF-β1刺激組比較,P-ERK1/2、

17、P-JNK、P-p38和P-Smad2的表達(dá)量均無(wú)明顯變化。
　　小結(jié)：成功將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1.DCN和DCN siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠MC內(nèi)。DCN過(guò)表達(dá)抑制由TGF-β1促進(jìn)的Ⅳ型膠原的表達(dá),而用siRNA干擾DCN表達(dá)后,TGF-β1誘導(dǎo)的MC中Ⅳ型膠原合成又升高,表明了DCN是影響TGF-β1誘導(dǎo)基質(zhì)合成的重要因素。
　　DCN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,可下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的P-ERK1/2、P-JNK、P-p38MAP

18、K和P-Smad2磷酸化水平,說(shuō)明DCN表達(dá)上調(diào)可以拮抗TGF-β1對(duì)ERK、JNK、p38MAPK和Smad2的活化作用。DCNRNA干擾后,對(duì)P-ERK1/2、P-JNK、P-p38MPAK和P-Smad2磷酸化水平無(wú)明顯影響,提示細(xì)胞生理性情況下的DCN對(duì)細(xì)胞內(nèi)MAPKs和Smad2的活化無(wú)顯著作用。
　　結(jié)論：
　　1.TGF-β1活化的Smad2信號(hào)通路和ERK1/2、p38、JNK信號(hào)通路均參與了TGF-β1對(duì)大