煙草提取物通過TGF-β1-SMAD2通路誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：研究煙草提取物(CSE)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的影響并探究其中的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)大鼠肺泡上皮RLE-6TN細(xì)胞株24h后，分別加入0.5％，1.0%和2.0%CSE共培養(yǎng)48h，Hoechst染色法檢測(cè)煙草提取物對(duì)細(xì)胞核變化的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率；蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming Growth Factor-beta1

2、,TGF-β1)，smad2的表達(dá)量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3裂解片段(Cleaved caspase-3)的活性。
　　2.TGF-β1受體抑制劑(SB431542)500nmol·L-1作用RLE-6TN細(xì)胞株24h后，加入2.0% CSE共培養(yǎng)48h。Western blot分別檢測(cè)Smad2和Cleaved caspase-3的活性。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)不同濃度的CSE(0.5%，1.0%，2.0%)作用

3、RLE-6TN細(xì)胞48h后，經(jīng)Hoechst染色后，各CSE處理組均可見部分凋亡細(xì)胞，胞核發(fā)白、固縮、染色質(zhì)邊集等現(xiàn)象，對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的淡藍(lán)色熒光。隨機(jī)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為：對(duì)照組(3.671±1.04)%，0.5%CSE處理組(16.606±6.645)%，1.0%CSE處理組(18.626±3.596)%以及2.0%CSE處理組(31.035±4.373)%,各CSE處理組凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

4、(P＜0.05)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞早期凋亡率分別為：對(duì)照組(5.270±0.526)%,0.5%CSE處理組(22.563±1.048)%，1.0%CSE處理組(27.467±0.735)%以及2.0% CSE處理組(32.580±0.413)%，各CSE處理組細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3. Western Blot結(jié)果顯示各CSE處理組TGF-β1、Smad2、磷酸化s

5、mad2(p-Smad2)蛋白表達(dá)量與Cleaved caspase-3活性較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.經(jīng)TGF-β1受體抑制子(SB431542)干預(yù)48h后，SB431542干預(yù)組p-Smad2蛋白表達(dá)量及Cleaved caspase-3活性較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)；SB431542+2.0% CSE處理組p-Smad2蛋白表達(dá)量及Cleaved caspase-3活性較2.0%CS