mTOR-p70s6k-PKM2通路影響TGF-β1誘導(dǎo)宮頸癌上皮間質(zhì)變機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　宮頸癌（cervical cancer，CC）擁有較高的發(fā)病率，占所有女性腫瘤的15％，位居第二。目前，宮頸癌出現(xiàn)新的情況，其出現(xiàn)新的上升、年輕化趨勢(shì)。
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路不僅在正常的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中起關(guān)鍵作用，而且影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、分化、增殖，甚至凋亡。其機(jī)制在于mTOR信號(hào)通路影響上游信號(hào)通路磷酸化的mTOR通路后，

2、產(chǎn)生應(yīng)答效應(yīng)，調(diào)節(jié)其下游核糖體 S6蛋白激酶（S6 kinase，S6K），從而調(diào)控mRNAs翻譯轉(zhuǎn)錄。靶蛋白核糖體S6蛋白激酶（S6 kinase，S6K）是mTOR下游最具特色的蛋白之一，P70S6K的功能是使 S6K磷酸化，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，抑制 mTOR通路，阻滯G1期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，以達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的目的。
　　腫瘤相較正常細(xì)胞，周期調(diào)控發(fā)生紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤與 mTOR通路存在密切的關(guān)系，mTOR通路密切參與腫

3、瘤細(xì)胞的周期、增殖、遷移、能量代謝和蛋白合成。Warburg曾經(jīng)提出腫瘤代謝消耗大量的葡萄糖糖并產(chǎn)生大量乳酸，其產(chǎn)生的過(guò)程與丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）密切相關(guān)。文獻(xiàn)證實(shí)，PK是調(diào)節(jié)能量代謝關(guān)鍵途徑。其中，PKM2分為活性弱的二聚體，活躍的四聚體。二聚體在腫瘤細(xì)胞中伴隨壞死和轉(zhuǎn)移，可以釋放入血中。文獻(xiàn)已報(bào)道，mTOR和PKM2密切相關(guān)，上調(diào)PKM2的表達(dá),導(dǎo)致Warburg效應(yīng)。
　　腫瘤上皮間質(zhì)變（epit

4、helial-to-mesenchymal transition，EMT）增加腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。研究顯示，TGF-β1可以誘導(dǎo)建立EMT模型，影響mTOR參與非Smad獨(dú)立信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制。
　　二甲雙胍作為糖尿病藥物，其發(fā)揮作用是通過(guò)降低胰島素抵抗和降低空腹血漿胰島素水平。相比使用其他降糖藥的患者，給與二甲雙胍治療二型糖尿病患者，更加不容易患癌癥，并且可以降低多種腫瘤發(fā)病率，提高患者生存期。其抗腫瘤機(jī)制在于：通過(guò)激活A(yù)MPK通路

5、，磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2（Tuberous sclerosis complex gene2，TSC2）TSC2，形成TSC1/2復(fù)合體直接抑制mTOR通路，從而抑制下游p70s6k活性，影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和合成。
　　目的：
　　本課題為了驗(yàn)證宮頸癌上皮間質(zhì)變下相關(guān)機(jī)制，使用TGF-β1誘導(dǎo)建立EMT模型，同時(shí)輔助添加有或無(wú)雷帕霉素阻滯 mTOR通路，驗(yàn)證相關(guān)通路蛋白，從而證明存在mTOR通路機(jī)制，進(jìn)而用二甲雙胍驗(yàn)證mTO

6、R通路機(jī)制。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)以宮頸癌Hela、Siha細(xì)胞作為研究對(duì)象，使用不同劑量的雷帕霉素阻滯mTOR通路，檢測(cè)雷帕霉素對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及驗(yàn)證相關(guān)機(jī)制。第二步，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建EMT模型：不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞48-96小時(shí)，觀測(cè)宮頸癌細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性，進(jìn)而驗(yàn)證宮頸癌EMT和PKM2關(guān)系。第三步，在建立 EMT細(xì)胞模型后，分別給予有或無(wú)雷帕霉素和TGF-β1處理宮頸癌細(xì)胞。檢測(cè)EMT下，mTO

7、R通路影響EMT細(xì)胞生物特性及其機(jī)制。第四步，分別給予有或無(wú)二甲雙胍和TGF-β1處理宮頸癌細(xì)胞，驗(yàn)證mTOR/p70s6k/PKm2通路存在。具體實(shí)驗(yàn)
　　方法：
　　CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖；劃痕測(cè)定遷移；流式儀檢測(cè)凋亡；Western blot檢測(cè) E-cadherin、STATA3、Snail2、vimentin、p-p70s6k和PKM2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）雷帕霉素阻滯mTOR通路：雷帕霉素

8、能夠抑制Siha和Hela細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴方式。在72 h時(shí)，25nM、50nM、100nM雷帕霉素具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在Hela細(xì)胞G0/G1期，細(xì)胞數(shù)目增加（50.8%至64%)，S期細(xì)胞數(shù)目減少（40.2%至30.7%)。在Siha細(xì)胞，雷帕霉素導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目在G0/G1期（55.2%至70.7%)顯著增加，而S期細(xì)胞數(shù)目從38.3%下降到24%。雷帕霉素劑量增加，Siha細(xì)胞細(xì)胞總凋亡細(xì)胞的百分比(早期凋亡+晚期凋亡

9、)顯著增加（0.8%至53.5%)。同樣，Hela細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞增多（0.1%至77%)。給予mTOR通路阻滯劑（雷帕霉素）后，影響其下游減少磷酸化p70S6K水平，從而下調(diào)PKM2表達(dá)。
　　（2）建立宮頸癌EMT模型及檢測(cè)與PKM2關(guān)系：給予TGF-β1處理細(xì)胞48h后，多數(shù)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)變表現(xiàn)為：上皮細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間隙增大。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力顯示：各濃度TGF-β1對(duì)Siha和Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率未發(fā)現(xiàn)

10、減少，10ng/ml TGF-β1對(duì)細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)關(guān)系。體外劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示10ng/ml劑量組劃痕間距較空白組明顯變小。TGF-β1誘導(dǎo)EMT后，流式細(xì)胞儀結(jié)果凋亡明顯減少。在Hela細(xì)胞中給予TGF-β1誘導(dǎo)后早期凋亡有0.1%下降為0.0%，總的凋亡由1.2%下降為0.1%。同樣，Siha細(xì)胞TGF-β1誘導(dǎo)后早期凋亡有0.6%下降為0.4%，總的凋亡由1.4%下降為1.3%。TGF-β1處理48h， E－鈣粘蛋白表達(dá)明顯減少

11、，波形蛋白表達(dá)明顯增加。驗(yàn)證成功建立EMT模型。檢測(cè)PKM2顯示：誘導(dǎo)建立EMT后，PKM2明顯增加。
　?。?）提出宮頸癌上皮簡(jiǎn)質(zhì)變下mTOR/70s6k/PKM2通路機(jī)制：TGF-β1可以誘導(dǎo)建立宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)變，促進(jìn)增殖和遷移。雷帕霉素能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)改變的細(xì)胞增殖和扭轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。TGF-β1處理細(xì)胞總凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）顯著下降相比。50nM雷帕霉素處理組細(xì)胞凋亡率顯著

12、增加。此外，雷帕霉素的加入顯著逆轉(zhuǎn)了Hela和Siha細(xì)胞系中TGF-β1誘導(dǎo)的抗凋亡作用。Western blot結(jié)果：細(xì)胞給予TGF-β1作用后，減少E-cadherin表達(dá)，增加vimentin表達(dá)，而雷帕霉素組E-cadherin相對(duì)表達(dá)增加，而vimentin表達(dá)減少。此外，在TGF-β1誘導(dǎo)下，mTOR通路被激活，其下游磷酸化p70s6k表達(dá)增加，而雷帕霉素抑制mTOR通路，磷酸化P70S6K表達(dá)減少。此外，在EMT中，抑制

13、mTOR通路同樣降低PKM2表達(dá)。
　?。?）驗(yàn)證宮頸癌上皮簡(jiǎn)質(zhì)變下mTOR/70s6k/PKM2通路機(jī)制：二甲雙胍呈現(xiàn)劑量依賴方式抑制Hela細(xì)胞的增殖。TGF-β1治療在72h顯著增加細(xì)胞，加二甲雙胍可以減少宮頸癌增殖。Siha細(xì)胞有相似的效果。TGF-β1顯著增加Hela細(xì)胞的遷移能力，二甲雙胍逆轉(zhuǎn)了TGF-β1引誘的遷移能力。類(lèi)似，二甲雙胍能夠減少Hela細(xì)胞的遷移。另外，Siha細(xì)胞具有相同細(xì)胞遷移情況。TGF-β1處理

14、細(xì)胞，Hela和Siha細(xì)胞，細(xì)胞的總凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）顯著下降相比未經(jīng)處理細(xì)胞。在給予10mM二甲雙胍治療細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率顯著增加。此外，二甲雙胍顯著逆轉(zhuǎn)Hela和Siha兩種細(xì)胞，TGF-β1誘導(dǎo)的抗凋亡作用。此外，二甲雙胍的抗腫瘤效果，相似mTOR抑制劑抑制腫瘤效果。二甲雙胍部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1建立的上皮間質(zhì)變。Western blot研究顯示：在Hela和SiHa細(xì)胞中，TGF-β1顯著誘導(dǎo)磷酸化的p70s6k。同時(shí)，T

15、GF-β1顯著增加PKM2中的表達(dá)。二甲雙胍降低p-p70s6k和PKM2的表達(dá)。二甲雙胍逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)，降低p-p70s6k和PKM2的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、雷帕霉素能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)凋亡及阻滯細(xì)胞周期，涉及影響mTOR/P70S6K/PKM2通路機(jī)制。
　　2、TGF-β1誘導(dǎo)建立宮頸癌EMT，其明顯促進(jìn)了細(xì)胞的增殖、遷移、抑制凋亡，并且證明上皮間質(zhì)變（EMT）明顯與PKM2密切相關(guān)。<