過量醛固酮對SD大鼠心臟結(jié)構(gòu)的影響及其機制探討.pdf

1、醛固酮在心血管疾病中的作用日益受到重視。臨床研究顯示醛固酮水平不適當(dāng)升高可導(dǎo)致心臟受損。由于存在諸如樣本量大小、人種差異、飲食、藥物、伴發(fā)疾病以及倫理等因素的影響，在人體上研究過量醛固酮對心臟的影響比較困難，而動物實驗可較好的控制這些因素。
　　 既往動物實驗顯示過量醛固酮可通過氧化應(yīng)激和炎癥等途徑導(dǎo)致心臟受損，然而這些研究絕大多數(shù)是在高醛固酮血癥合并高鈉鹽飲食或低血鉀的大鼠模型上進行的。在高鈉鹽飲食和低血鉀的情況下，很難觀察單

2、純過量醛固酮對心臟的確切作用。此外，臨床上原發(fā)性醛固酮增多癥以及其他如慢性心衰等存在高醛固酮血癥的患者有相當(dāng)一部分并不存在高鈉鹽飲食和低鉀血癥。因此有必要在正常鈉鹽飲食和正常血鉀的情況下，進一步探討過量醛固酮對心臟的影響及其作用機制。
　　 再者，醛固酮和脂肪組織之間存在交互效應(yīng)。醛固酮可促進脂肪細(xì)胞分化成熟，同時原醛癥患者血漿脂聯(lián)素水平較正常血壓對照和原發(fā)性高血壓患者低，但心臟損傷的風(fēng)險卻較高。脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的一種脂肪細(xì)

3、胞因子，低脂聯(lián)素水平預(yù)示著心血管疾病風(fēng)險的增加。因此，脂聯(lián)素可能與醛固酮介導(dǎo)的心臟損害有關(guān)。但原醛癥患者血漿脂聯(lián)素水平的下降是醛固酮直接作用于脂肪細(xì)胞引起還是由于高鈉飲食、低鉀血癥或其他未知因素引起還不清楚。此外，已經(jīng)明確脂肪細(xì)胞上存在鹽皮質(zhì)激素受體(MR)，那么醛固酮有可能通過MR途徑直接影響脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的合成和分泌，這些均需進一步研究明確。
　　 本研究主要目的：1.在無高鈉鹽飲食和低血鉀的情況下，觀察過量醛固酮作用4周對

4、SD大鼠心肌結(jié)構(gòu)以及炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)和血漿脂聯(lián)素水平的影響。2.進行動物和細(xì)胞實驗觀察醛固酮可否直接作用于脂肪細(xì)胞引起脂聯(lián)素表達(dá)變化?醛固酮的這種作用是否與MR有關(guān)?
　　 第一部分醛固酮對SD大鼠心臟結(jié)構(gòu)的影響
　　 研究目的：
　　 在正常鈉鹽飲食和正常血鉀的情況下，探討過量醛固酮作用4周對SD大鼠心肌結(jié)構(gòu)以及炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)和血漿脂聯(lián)素水平的影響。
　　 研究方法：
　　 1.實驗分組<

5、br>　　 健康雄性SD大鼠隨機分為三組(每組10只)：①正常對照組(CON)；②醛固酮組(ALD)：醛固酮溶解在5％的乙醇中，裝入微泵植入大鼠頸后皮下組織，以0.75μg/h的速度持續(xù)皮下輸注4 w。③醛固酮+安體舒通組(SPI)：皮下輸注醛固酮，同時予以安體舒通100 mg.kg-1.day-1灌胃4 w。所有大鼠均自由攝食(含0.5％NaCl)。為防止醛固酮造成的低鉀血癥，自由飲用0.4％氯化鉀水。
　　 2.標(biāo)本收集<

6、br>　　 實驗結(jié)束前一日行代謝籠實驗，留取24 h尿。實驗結(jié)束當(dāng)日，腹腔麻醉后，下腔靜脈穿刺取血，迅速分離血漿，-80℃凍存?zhèn)溆??？焖俜蛛x心臟，稱重，留取左心室心肌標(biāo)本行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)檢查。
　　 3.觀察指標(biāo)
　　 3.1基本參數(shù)的測定
　　 記錄24 h尿量和攝食量，測定24 h尿鈉、鉀排出量和同步血漿鈉、鉀濃度。RIA測定血漿醛固酮水平和血漿腎素活性。
　　 3.2體重和血壓監(jiān)測
　　

7、 每周測量體重和血壓。血壓采用tail-cuff法測量大鼠清醒狀態(tài)下收縮壓(SBP)。
　　 3.3心肌形態(tài)學(xué)檢查
　　 透射電鏡和HE染色光鏡下觀察心肌形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.4免疫組化法檢測心肌ED-1表達(dá)
　　 陽性表達(dá)呈棕黃色，表示有單核/巨噬細(xì)胞浸潤。
　　 3.5比色法測定血漿和心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)
　　 丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性反映氧化應(yīng)激水平。

8、>　　 3.6實時PCR測定心肌NADPH氧化酶亞基p47phox和p22phox的基因表達(dá)
　　 3.7 ELISA法測定血漿超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)和脂聯(lián)素水平
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 小結(jié)：
　　 1.在正常鈉鹽飲食和正常血鉀的情況下，0.75μg/h醛

9、固酮作用4周可引起SD大鼠電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 2.醛固酮作用4周導(dǎo)致SD大鼠心肌局部MDA水平、SOD活性和心肌p47phox基因表達(dá)增加，而此時心肌局部無明顯炎癥表現(xiàn)，提示醛固酮介導(dǎo)心肌局部氧化應(yīng)激反應(yīng)增強早于心肌炎癥的出現(xiàn)。
　　 3.醛固酮可導(dǎo)致SD大鼠血漿脂聯(lián)素水平下降。
　　 4.安體舒通可阻止過量醛固酮對心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，這種作用不完全依賴于血壓下降。
　　 第二部分醛固酮對脂肪

10、細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響
　　 研究目的：
　　 在第一部分觀察到醛固酮導(dǎo)致SD大鼠血漿脂聯(lián)素水平降低的基礎(chǔ)上，進行動物和細(xì)胞實驗進一步觀察醛固酮可否直接作用于脂肪細(xì)胞引起脂聯(lián)素表達(dá)變化?醛固酮的這種作用是否與MR有關(guān)?
　　 研究方法：
　　 1.動物實驗
　　 實驗動物分組、體重和血壓監(jiān)測、代謝指標(biāo)觀察以及血漿脂聯(lián)素水平的測定同第一部分。實驗結(jié)束時，下腔靜脈穿刺取血，快速分離附睪脂肪墊脂肪組織，用

11、于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析。
　　 2.細(xì)胞實驗
　　 3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，油紅O染色鑒定。實驗分為5組，分別是對照組(CON)：含25 mmol/L葡萄糖DMEM高糖培養(yǎng)；低醛固酮組(LA)和高醛固酮組(HA)：分別含10-8和10-6 mol/L醛固酮；低醛固酮+安體舒通組(LA+SP)和高醛固酮+安體舒通組(HA+SP)：分別含10-8和10-6 mol/L醛固酮加10-6mol/L安體舒通

12、。每組分別處理24 h和48 h。重復(fù)3次。
　　 3.免疫組化染色分析脂肪組織MR表達(dá)
　　 4.ELISA法檢測大鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液中脂聯(lián)素水平
　　 5.實時定量PCR檢測大鼠脂肪組織及3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素和MR mRNA表達(dá)
　　 6.免疫印跡法檢測大鼠脂肪組織及3T3-L1脂肪細(xì)胞胞漿和胞核中MR總蛋白表達(dá)
　　 7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 同第一部分
　　 小結(jié)：