一個新的CD2胞內(nèi)區(qū)結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的初步研究.pdf

1、CD2分子是分布于胸腺細胞及所有成熟T淋巴細胞和大部分自然殺傷細胞表面的特征性分化抗原。CD2具有調(diào)節(jié)T淋巴細胞分化、成熟、激活和凋亡等功能，是介導T細胞抗原識別、粘附和介導淋巴細胞信號傳遞的重要細胞表面抗原。其富含脯氨酸的，帶正電荷的胞內(nèi)區(qū)具有信號傳遞和細胞粘附調(diào)節(jié)兩種功能，對于CD2的功能至關重要。尋找細胞內(nèi)可與CD2胞內(nèi)區(qū)相互作用的信號蛋白是CD2分子免疫學功能研究的熱點之一。本實驗室通過酵母雙雜交系統(tǒng)，在人KT3T淋巴細胞cDN

2、A文庫中篩選到一個與CD2胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的蛋白分子，經(jīng)與GeneBank數(shù)據(jù)庫比較分析此蛋白為人v-fos轉(zhuǎn)化效應蛋白(Fte-1)，其與人核糖體小亞基蛋白S3a(RPS3a)為同一基因產(chǎn)物。Fte-1由264個氨基酸殘基組成，分子量為29.9KD。 Fte-1被認為是一種典型的單基因多功能的蛋白，在多種腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化的細胞系中高水平表達。其除了作為核糖體小亞基的一個組成蛋白，參與翻譯起始之外，還具有復雜的核糖體外的功能，尤其在調(diào)節(jié)

3、細胞的存活，凋亡和轉(zhuǎn)化方面具有重要功能。其與CD2的相互作用尚屬首次發(fā)現(xiàn)。 本論文圍繞CD2胞內(nèi)區(qū)和Fte-1的相互作用進行了以下研究： 1.應用IAsyplusAffinitysensor生物大分子相互作用系統(tǒng)在體外研究CD2胞內(nèi)區(qū)和Fte-1的相互作用。證明其確實為特異性的相互結(jié)合作用。KD值為2×10-7， 2.將Fte-1蛋白序列提交PROSITE數(shù)據(jù)庫分析，證明其并不包含與蛋白質(zhì)相互作用相關的特殊結(jié)構(gòu)域

4、。但其含有三個可能的PKC磷酸化位點。 3.體外磷酸化實驗證明Fte-1蛋白可被PKC磷酸化。進一步構(gòu)建包含不同可能PKC磷酸化位點的缺失片段的表達載體，獲得各缺失突變的多肽后，進行體外磷酸化實驗。證明，F(xiàn)te-1蛋白只有其C-端的可被磷酸化。將Ser238突變?yōu)镚ly后，此位點不再被磷酸化。 4.通過體內(nèi)磷酸化實驗進一步驗證Fte-1蛋白可被內(nèi)源性的PKC磷酸化。 5.同時考察缺失片段與CD2胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合作用，

5、發(fā)現(xiàn)當Fte-1蛋白C-端237位之后包含PKC作用位點的片段缺失后，與CD2胞內(nèi)區(qū)不再結(jié)合。而N-端缺失對其與CD2胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合作用沒有影響。這證明Fte-1的C-末端對其與CD2胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合作用非常重要，這可能與PKC的磷酸化作用相關。 6.利用Pulldown方法確證Fte-1與CD2胞內(nèi)區(qū)的相互作用。 7.利用激光共聚焦技術觀察到，F(xiàn)te-1蛋白在細胞內(nèi)的定位為簇集性的分布，可能與其參與核糖體組成有關。其N-端對

6、其在細胞內(nèi)的定位很重要，C-端的部分缺失不影響其在細胞內(nèi)表達后的定位。 8.在抗CD2單克隆抗體T11刺激Jurkat細胞后，F(xiàn)te-1的定位發(fā)生明顯變化，與CD2共定位于細胞膜上。提示在細胞內(nèi)Fte-1與CD2胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合有賴于CD2介導的細胞激活信號。 9.Fte-1蛋白PKC磷酸化位點的突變使Fte-1失去與CD2分子共定位的能力，說明Fte-1的PKC磷酸化對Fte-1和CD2在T淋巴細胞內(nèi)的結(jié)合至關重要。

7、 單獨用PMA刺激細胞，僅使Fte-1失去簇集分布的特征，但并不使其與CD2共定位。推測PKC磷酸化可能是Fte-1與CD2胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的下游事件，參與了CD2介導的信號傳遞。 10.使用反義序列或siRNA抑制Fte-1在Jurkat細胞中的表達，可以抑制Jurkat細胞激活后的細胞凋亡。提示Fte-1可能參與對T細胞激活和死亡的調(diào)節(jié)，其機理可能與Fte-1與CD2的相互作用有關。 本研究證明，F(xiàn)te-1與CD2在T細