海馬低頻電刺激對(duì)KA點(diǎn)燃大鼠GABAA受體α1和β2亞基表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　研究海馬低頻電刺激（LFS）對(duì)海人酸致癲癇大鼠海馬突觸內(nèi)GABAA受體α1和β2亞基表達(dá)的影響，了解LFS對(duì)難治性癲癇的治療機(jī)制。
　　材料和方法：
　　6-8周齡雄性SD大鼠，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重250～280g，單籠飼養(yǎng)，晝夜循環(huán)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為癲癇組、假手術(shù)組、治療組和空白對(duì)照組，每組n=10只：（1）癲癇組：立體定向下將海人酸（KA）注射至左側(cè)海馬CA3區(qū)（坐標(biāo)：前囟后5.0mm

2、，旁開(kāi)4.8mm，深度4.8mm）建立KA點(diǎn)燃模型；（2）假手術(shù)組：KA點(diǎn)燃后只在右側(cè)海馬植入電極而不進(jìn)行LFS；（3）LFS治療組：KA點(diǎn)燃后在右側(cè)海馬植入電極，通過(guò)A-M SYSTEMS2100刺激器進(jìn)行LFS。刺激參數(shù)為：脈沖雙向方波，累計(jì)時(shí)間30分鐘，波寬lms，強(qiáng)度100μA，頻率1Hz，每天固定時(shí)間刺激1次，連續(xù)2周。（4）空白對(duì)照組不予任何處理。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后觀察點(diǎn)燃大鼠行為學(xué)表現(xiàn)和監(jiān)測(cè)腦電圖；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一部分大鼠斷頭取腦，

3、剝離出海馬組織凍存；另一部分大鼠活體灌注行石蠟包埋。通過(guò)尼氏染色檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)海馬α1和β2亞基mRNA表達(dá)情況；通過(guò)免疫組化和Western-Blot檢測(cè)海馬α1和β2亞基蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊性檢驗(yàn)后組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以p≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物模

4、型的行為學(xué)表現(xiàn)：注射海人酸后大鼠最初表現(xiàn)為抖須、閉眼、流涎、面肌痙攣、節(jié)律性的咀嚼，隨后出現(xiàn)濕狗樣抖動(dòng)、前肢上抬、抽搐隨即跌倒，發(fā)作劇烈者，可出現(xiàn)突然跳躍，不停旋轉(zhuǎn)。
　　2.腦電圖：KA致癇后典型的癲癇波型有單棘波、多相棘波、雙相棘波、棘-慢波、陣發(fā)性高幅尖波節(jié)律，期間有發(fā)作性后抑制，其中以多發(fā)棘波為主且頻繁出現(xiàn)。
　　3.尼式染色：癲癇組、假手術(shù)組、治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列松散、紊亂、缺失嚴(yán)重，輪廓不清，胞核結(jié)構(gòu)模糊

5、，核仁不明顯，甚至消失?？瞻讓?duì)照組CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)清晰，排列整齊，胞核結(jié)構(gòu)清晰，胞漿中可見(jiàn)尼式小體，神經(jīng)元未見(jiàn)異常形態(tài)改變。說(shuō)明海馬LFS治療不能逆轉(zhuǎn)受損傷的神經(jīng)元。
　　4.RT-PCR：TRIzol法提取海馬組織總RNA，RT-PCR儀分析mRNA表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示α1亞基在癲癇組、假手術(shù)組、治療組和空白對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)為0.32±0.21、0.35±0.18、3.81±0.33、4.23±0.16；β2亞基為

6、0.49±0.22、0.52±0.25、2.08±0.30、2.44±0.19。癲癇組、假手術(shù)組與治療組、空白對(duì)照組之間α1亞基、β2亞基表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.01）；癲癇組與假手術(shù)組（p﹥0.05），及治療組與空白對(duì)照組之間α1和β2亞基表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥0.05）。
　　5.免疫組織化學(xué)：神經(jīng)元胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性。α1亞基平均吸光密度（IA）值法在癲癇組、假手術(shù)組、治療組與空白對(duì)照組分別表達(dá)量：0.09±0

7、.02、0.10±0.02、0.21±0.03、0.24±0.01；β2亞基分別為：0.06±0.02、0.07±0.03、0.15±0.02、0.18±0.04。癲癇組、假手術(shù)組與治療組、空白對(duì)照組之間α1、β2亞基表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05），但癲癇組與假手術(shù)組（p﹥0.05），以及治療組與空白對(duì)照組之間α1、β2亞基表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥0.05）。提示海馬LFS能使癲癇大鼠GABAA受體α1及β2亞基表達(dá)上調(diào)。<

8、br>　　6.Western-Blot：Gel-Pro analyzer凝膠成像分析軟件計(jì)算出相對(duì)灰度值；可見(jiàn)α1亞基在癲癇組、假手術(shù)組、治療組和空白對(duì)照組的相對(duì)灰度值為：0.29±0.03、0.21±0.07、0.65±0.17、0.79±0.15；β2亞基為0.16±0.09、0.18±0.02、0.53±0.06、0.66±0.15。治療組α1和β2亞基蛋白表達(dá)量較癲癇組和假手術(shù)組明顯升高，但仍低于正常水平。癲癇組、假手術(shù)組與治療