多重耐藥大腸埃希菌喹諾酮類藥物外排泵抑制劑中藥活性成分的篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái),隨著抗微生物藥物的廣泛應(yīng)用,抗微生物藥物耐藥性問(wèn)題也日趨嚴(yán)重,這導(dǎo)致藥物臨床療效的降低,甚至無(wú)效,感染畜禽的發(fā)病率和死亡率明顯升高。而現(xiàn)有藥物對(duì)細(xì)菌耐藥性問(wèn)題控制較難,研制耐藥抑制劑逐漸成為藥學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。針對(duì)如何解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題,國(guó)外研究人員已研制了部分耐藥性抑制劑,如利血平、氰氯苯腙(CCCP)、2,4-二硝基酚(DNP)等,雖然其對(duì)耐藥性均有一定的抑制作用,但其本身的毒性也較大。因此,研究低毒、有效的耐藥性抑制劑具

2、有廣闊的應(yīng)用價(jià)值和良好的前景。中藥是我國(guó)特有的天然資源,具有資源廣、毒副作用低等特點(diǎn),在治療感染、逆轉(zhuǎn)(或抑制)腫瘤細(xì)胞耐藥性等方面顯示了獨(dú)特的作用,這提示可以在中藥中尋找既有良好耐藥消除效果又沒(méi)有毒副作用或毒副作用較低的耐藥抑制劑。本試驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)以臨床常見(jiàn)100味中草藥為研究對(duì)象,篩選對(duì)多重耐藥大腸埃希菌喹諾酮類藥物具有外排泵抑制作用的中藥活性成分,旨在為研制新的耐藥抑制劑奠定基礎(chǔ)。
　　 1.具有單一外排耐藥機(jī)制的大腸埃

3、希菌模型的確立
　　 以本研究室鑒定、保存的20株多重耐藥大腸埃希菌為樣本,進(jìn)行染色體DNA提取,通過(guò)PCR方法擴(kuò)增gyrA和parC基因耐藥決定區(qū),產(chǎn)物測(cè)序分析?；蚰退帥Q定區(qū)朱發(fā)生突變者,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),對(duì)其外排泵基因acrA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),并應(yīng)用CCCP為外排泵抑制劑進(jìn)行檢測(cè),高表達(dá)且經(jīng)CCCP處理后,菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星蓄積量增加最顯著者,確立為本試驗(yàn)所需的具有單一外排機(jī)制的大腸埃希菌模型。
　　 結(jié)果

4、:在20株多重耐藥大腸埃希菌中,gyrA和parC基因朱發(fā)生突變的有兩株,而其中73-2存在外排泵基因高水平表達(dá),故將此株細(xì)菌作為后續(xù)試驗(yàn)的細(xì)菌模型。
　　 2.中藥細(xì)菌外排泵抑制劑的篩選
　　 采用水提與醇提法,針對(duì)每一味中藥制備兩種中藥儲(chǔ)備液,通過(guò)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的肉湯稀釋法,測(cè)定乳酸環(huán)丙沙星及200種中藥提取物對(duì)耐藥菌及質(zhì)控菌ATCC25922的最小抑菌濃度(MIC),并將中藥提取物與

5、乳酸環(huán)丙沙星聯(lián)合,檢測(cè)其對(duì)乳酸環(huán)丙沙犀的協(xié)同作用。
　　 結(jié)果:得到中藥儲(chǔ)備液200種,其中對(duì)耐藥大腸埃希菌有抑菌作用的有142種,抑菌率為71%;存在聯(lián)合抑菌效果的有4種,分別是A,B,C,D。耐藥抑制作用表現(xiàn)為使大腸埃希菌耐藥模型MIC下降4～64倍;124種中藥提取物與乳酸環(huán)丙沙星聯(lián)用表現(xiàn)為拮抗作用。
　　 結(jié)論:部分中藥提取物聯(lián)合乳酸環(huán)丙沙星可以降低大腸埃希菌對(duì)乳酸環(huán)丙沙星的耐藥性,表現(xiàn)出良好的耐藥抑制作用,但大

6、多數(shù)中藥提取物與乳酸環(huán)形沙星聯(lián)用表現(xiàn)為拮抗作用,臨床需慎用。
　　 3.有效中藥提取物對(duì)受試菌株乳酸環(huán)丙沙星蓄積量的影響
　　 應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)質(zhì)控菌和耐藥菌在分別加入亞抑菌濃度四種中藥提取物前后,細(xì)菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星(Cip)的蓄積量。
　　 結(jié)果:加入四種中藥提取物后,質(zhì)控菌和耐藥菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星蓄積量均有所增加,其中加入A提液后,Cip蓄積量變化最為顯著,為3.7倍。
　　 結(jié)論:亞抑菌中藥

7、提取物可以增加大腸埃希菌耐藥菌與質(zhì)控菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星的蓄積量,表現(xiàn)出良好的外排抑制作用。
　　 4.中藥提取物對(duì)耐藥大腸埃希菌外排泵基因acrA基因表達(dá)量的影響
　　 通過(guò)亞抑菌濃度中藥提取物處理藥菌大腸埃希菌,利用熒光定量PCR技術(shù)(Real-TimeFluorescentQuantitativePCR)檢測(cè)其外排泵基因acrA表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果:處理后耐藥大腸埃希菌其acrA表達(dá)量均降低,經(jīng)亞抑菌濃