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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
我國肝臟疾病發(fā)病率高,影響面廣,對(duì)人民健康和國家經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了嚴(yán)重危害。因此,針對(duì)肝臟疾病的早期診斷及發(fā)病機(jī)制的研究具有十分重要的意義。
肝臟是機(jī)體重要的代謝器官,在物質(zhì)代謝過程中起了樞紐作用。當(dāng)肝臟發(fā)生病理改變時(shí),必然會(huì)導(dǎo)致與之相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生相應(yīng)的變化。代謝組學(xué)是從整體層面上檢測(cè)疾病狀態(tài)下代謝物的改變,因而代謝組學(xué)技術(shù)在肝臟疾病的早期診斷及發(fā)病機(jī)制等方面研究中起到了不可忽視的作用。糞便代謝物被認(rèn)
2、為腸道菌群和宿主共代謝的產(chǎn)物,它不僅可以反應(yīng)腸道菌群的狀態(tài),而且在共棲菌與宿主之間起著橋梁作用。因此應(yīng)用糞便上清代謝組學(xué)的方法來研究不同階段的肝病,對(duì)于研究肝病的發(fā)展與腸道菌群之間的聯(lián)系有著重要的指導(dǎo)意義。
腸道共生菌明顯影響宿主的代謝表型,廣泛參與了菌群與哺乳動(dòng)物的共代謝。肝臟與腸道菌群由于腸-肝軸建立了密切的解剖及生理功能關(guān)系。以往的研究表明,肝病時(shí)存在著腸道菌群失衡,但在肝病時(shí)腸道菌群失衡如何影響機(jī)體代謝尚未見報(bào)道。
3、
本研究首先建立基于超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC/MS)的糞便上清代謝組學(xué)方法,并應(yīng)用該技術(shù)對(duì)急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和健康人糞便上清的代謝物質(zhì)進(jìn)行代謝組學(xué)研究。進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法來分析肝硬化患者腸道主要菌群的變化,并分析腸道菌群的改變對(duì)機(jī)體代謝的影響。
第一部分:基于UPLC/MS的糞便上清代謝組學(xué)方法的建立及在不同肝病中的應(yīng)用
方法:重點(diǎn)考察甲醇/糞便(v/g)的比
4、例、過濾膜的大小、電噴霧離子化模式對(duì)提取糞便代謝物的影響;建立基于超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC/MS)的糞便上清代謝組學(xué)方法。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和健康人進(jìn)行糞便上清代謝組學(xué)研究。結(jié)合多變量數(shù)據(jù)分析來研究不同階段肝病代謝譜的變化規(guī)律,評(píng)估代謝譜對(duì)不同階段肝病診斷的有效性。
結(jié)果:建立了基于UPLC/MS的糞便上清代謝組學(xué)方法。確定甲醇/糞便(v/g)的比例為:600ul/0.2g,過濾膜的大小為(
5、0.22um),正離子模式,經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法重復(fù)性好、靈敏度高、分辨率高,適用于糞便上清代謝物的快速、高通量檢測(cè)。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和健康人進(jìn)行糞便上清代謝組學(xué)分析,對(duì)正常組與不同肝病組代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal components analysis,PCA)分析,結(jié)果顯示正常組與疾病組的代謝譜有顯著差別,但疾病組之間未能完全分別聚類,進(jìn)一步運(yùn)用監(jiān)督的正交偏最小方差判別分析(Orth
6、ogonal Partial least squares-Discriminant Analysis,OPLS-DA)多變量統(tǒng)計(jì)方法對(duì)5組樣本重新建模,結(jié)果顯示正常組與不同疾病組之間能很好地區(qū)分,不同肝病組之間也能基本分開,提示用此模型可以對(duì)不同肝病進(jìn)行診斷。為了分析不同肝病患者糞便上清代謝物的變化趨勢(shì),對(duì)分組貢獻(xiàn)(VIP值)較大的代謝物進(jìn)行了提取并鑒定了三大類物質(zhì):在肝病患者糞便中,膽汁酸和膽素原顯著減少,溶血磷脂酰膽堿顯著增加,進(jìn)一
7、步發(fā)現(xiàn)膽汁酸降低的嚴(yán)重程度依肝癌、肝硬化、慢性肝炎、急性肝炎排列,以肝癌患者中含量最低,降低最明顯,這表明糞便中膽汁酸的含量可能與疾病進(jìn)展程度相關(guān)。
第二部分:肝硬化患者腸道菌群結(jié)構(gòu)改變對(duì)代謝的影響
方法:應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法來比較肝硬化患者與正常人群腸道主要菌群(腸球菌屬、腸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬和乳酸桿菌屬)的變化;對(duì)肝硬化UPLC/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)Mann——Whitney Te
8、st檢驗(yàn),結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析,篩選肝硬化患者糞便的生物標(biāo)志物,并分析腸道菌群改變對(duì)生物標(biāo)志物的影響。
結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸道主要菌群結(jié)果顯示:與正常人體比較,肝硬化患者腸桿菌科細(xì)菌顯著增加(P<0.01),擬桿菌、雙歧桿菌和梭菌顯著減少(P<0.05),腸球菌和乳酸桿菌無顯著性差異(P>0.05)。應(yīng)用PCA及最小二乘法判別分析(Partial least squares-Discriminant Analysi
9、s, PLS-DA)對(duì)正常人群與肝硬化患者UPLC/MS數(shù)據(jù)分析顯示,肝硬化患者和正常人群代謝譜有顯著不同。應(yīng)用非參數(shù)Mann——Whitney Test檢驗(yàn),結(jié)果顯示在9215個(gè)峰中,發(fā)現(xiàn)25.8%的峰即2393個(gè)峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中這些差異峰中有74.0%的代謝峰在肝硬化患者中下降,表明肝硬化患者大部分代謝產(chǎn)物都是下調(diào)的。根據(jù)VIP和非參數(shù)T-Test結(jié)果,我們鑒定了六大類物質(zhì):膽汁酸、膽素原、溶血磷脂酰膽堿、芳香族氨基酸、長鏈脂肪
10、酸和長鏈?;舛緣A。與正常人群比較,肝硬化患者膽汁酸及膽素原顯著減少,溶血磷脂酰膽堿、芳香族氨基酸、長鏈脂肪酸和長鏈酰基肉毒堿顯著增加。
結(jié)論
本課題在建立基于UPLC/MS糞便上清代謝組學(xué)方法的基礎(chǔ)上,通過對(duì)急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和健康人群的代謝組學(xué)研究,并結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)不同肝病的診斷具有一定作用,可以為臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù),同時(shí)發(fā)現(xiàn)糞便上清物中膽汁酸的含量可能提示疾病進(jìn)展
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