斑蝥酸鈉維生素B6注射液對腫瘤患者外周血T淋巴細胞增殖和細胞因子表達的影響.pdf

1、目的：根據中醫(yī)辨證理論，癌癥患者往往多種發(fā)病機制并存，故治療上也是多種治療方法并用。目前的研究成果表明，中藥主要通過以下幾個方面發(fā)揮臨床功效：調節(jié)免疫功能，抑制腫瘤新生血管的生成，誘導細胞分化，促進細胞凋亡，直接殺傷腫瘤細胞，逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥，抗突變作用，抗腫瘤細胞的轉移。中藥抗腫瘤是多方向、多途徑發(fā)揮作用的，在臨床中應堅持辨證論治與辨病論治相結合。 斑蝥為芫菁科昆蟲南方大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥全蟲，現代藥學研究表明其主要

2、藥用成分是斑蝥素。斑蝥酸鈉是斑蝥素經過氫氧化鈉水解生成的，其與維生素B6組成的復方制劑斑蝥酸鈉維生素B6注射液在保留斑蝥素抗癌作用的同時，其抗癌譜更廣，毒副作用更小。斑蝥酸鈉維生素B6注射液治療惡性腫瘤在臨床上已得到廣泛應用，過去的研究表明其抗癌機制主要是細胞毒作用，對于其它作用機制的研究，如通過調節(jié)免疫功能抗腫瘤的研究也只是局限于臨床研究。而對于其抑制腫瘤新生血管的生成、誘導細胞分化、促進細胞凋亡、逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥、抗突變作用、

3、抗腫瘤細胞的轉移等機制的研究尚未見相關報道。 本研究首次通過體外試驗，應用MTT法、流式細胞術、放射免疫、RT-PCR等多種方法，試圖從細胞、分子和基因水平研究斑蝥酸鈉維生素B6注射液對T淋巴細胞增殖和分泌IL-2、IL-4和趨化因子IL-8的影響，以進一步探討斑蝥酸鈉維生素B6注射液的免疫調節(jié)作用和抑制腫瘤新生血管生成的作用，為斑蝥酸鈉維生素B6注射液的進一步研發(fā)和臨床應用提供更加可靠的理論和實驗依據。 方法：

4、 1、外周血單個核細胞的分離：抽取惡性腫瘤患者靜脈血，采用：Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞即淋巴細胞。 2、MTT法測定植物血球凝集素(Fhvtohomaggiutinin，PHA)誘導的T淋巴細胞的增殖反應：將上述制備好的細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，設空白對照組、PHA對照組和7個不同藥物濃度的實驗組，T淋巴細胞培養(yǎng)72小時后倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學變化，用酶標儀測OD值。選兩個促增殖作用最明顯的藥物濃度組為實驗組并設．

5、PHA對照組進行后續(xù)試驗。 3、流式細胞儀測定T淋巴細胞周期：細胞進行培養(yǎng)，收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期。 4、放射免疫法測定IL-4和IL-8的含量：實驗組和對照組細胞進行培養(yǎng)后留取上清液，用IL-4和IL-8放免藥盒檢測其含量。 5、RT-PCR測定T淋巴細胞內IL-2mRNA的含量：實驗組和對照組細胞進行培養(yǎng)，收集細胞，提取細胞總RNA。采用一步法進行反轉錄和擴增。將RT-PCR產物用1.5％瓊脂糖凝

6、膠電泳后，應用凝膠成像系統及凝膠分析軟件對電泳條帶進行成像分析，用IL-2吸光度與B-actin吸光度的比值代表IL-2的相對含量。 6、所有數據均用X±S表示，用SPSS11.5統計軟件進行處理，多組間比較用方差分析，實驗組與對照組間比較用SNK-q檢驗，P<0.05有統計學意義。 結果： 1、在PHA協同刺激下，細胞培養(yǎng)72小時后，倒置顯微鏡觀察各組細胞均呈現集落狀生長，其中0.010ug/ml組細胞集落較

7、PHA對照組明顯增多，1.000ug/ml組細胞集落較PHA對照組減少。MTT結果顯示：斑蝥酸鈉維生素．B6注射液在一定范圍內，能刺激外周血T淋巴細胞的增殖，且隨著藥物濃度的增高促增殖作用增強。但當藥物達到一定濃度時，隨著濃度的增高促增殖作用減弱，達到較高濃度時甚至有殺傷T淋巴細胞的作用。其中促增殖作用最強的兩個濃度為0.010ug/ml和0.050ug/ml。 2、適當濃度的斑蝥酸鈉維生素B6注射液可以促進T淋巴細胞的活化，促

8、進細胞由G<,0>/G<,1>期向S期轉化。兩個實驗組的S期細胞百分率與對照組的S期細胞百分率相比差異有統計學意義(P<0.05)。 3、兩個實驗組IL-8的分泌與對照組相比降低且有統計學意義(P<0.05)。兩個實驗組之間相比無統計學意義(P>0.05)。 4、IL-4的分泌顯示出隨藥物濃度增高而增高的趨勢，但無統計學意義(P>0.05)。 5、適當濃度的斑蝥酸鈉維生素B6注射液可以促進T細胞內IL-2mRN

9、A的表達，兩個不同實驗組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。0.050ug/ml實驗組的作用較0.010ug/ml實驗組弱，且兩個不同實驗組比較差異有統計學意義(P<0.05)。 結論： 1、在PHA協同刺激下，斑蝥酸鈉維生素B6注射液在體外對T淋巴細胞有促進增殖作用，這種促進增殖作用是通過促進細胞從G<,0>/G<,1>期向S期轉化而實現的。斑蝥酸鈉維生素B6注射液可能通過促進T淋巴細胞的增殖直接增強機體的

10、免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。 2、當斑蝥酸鈉維生素。B6注射液藥物濃度達0.010ug/ml，促增殖作用最明顯，0.050ug/ml促增殖作用也比較明顯，隨著藥物濃度的增加，促增殖作用減弱，當達到一定濃度時出現抑制作用。提示我們臨床應用斑螫酸鈉維生素B6注射液時濃度應適宜。 3、斑蝥酸鈉維生素B6注射液可能通過下調淋巴細胞分泌趨化因子IL-8，進而減少腫瘤血管生成而起到抗腫瘤作用。 4、斑蝥酸鈉維生素B6注射液雖有