煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及維生素B6的檢測(cè).pdf

1、細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)中定向培養(yǎng)有效成分或活性物質(zhì)的有效途徑，也是工廠化生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的基礎(chǔ)。煙草作為植物組織培養(yǎng)中一種重要的實(shí)驗(yàn)材料，近年來(lái)以懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料開(kāi)展抗性研究、基因轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物等方面取得了一些進(jìn)展。煙草品種眾多，目前關(guān)于云煙21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的報(bào)道較少。本文以云煙21煙草葉片為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)產(chǎn)生疏松細(xì)胞，并對(duì)疏松細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得大量的煙草細(xì)胞，進(jìn)行VB6含量測(cè)定。為細(xì)胞培養(yǎng)提供方法，也

2、為研究VB6的代謝提供材料。
　　通過(guò)培養(yǎng)條件的選擇，選出愈傷組織誘導(dǎo)最佳配方為MS+6-BA3mg/L+NAA0.2mg/L。該配方在第10天時(shí)葉片四周形成眾多淡黃色顆粒狀愈傷組織，15天時(shí)愈傷組織細(xì)胞大量增殖，得到初代愈傷組織。
　　疏松易碎、生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織是進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵，本文研究了不同激素配比、繼代周期等對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L的配方適于愈傷組織的生長(zhǎng)

3、，繼代3次后可100％誘導(dǎo)出生長(zhǎng)旺盛、疏松易碎的愈傷組織，可用于懸浮培養(yǎng)。
　　通過(guò)對(duì)接種量、激素配比等因素的探討，選出最適細(xì)胞培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：將疏松的愈傷組織細(xì)胞接種到MS+2，4-D1.0mg/L的液體培養(yǎng)基中，0.75g/10mL的接種量。細(xì)胞在0～6天時(shí)生長(zhǎng)緩慢；第6天時(shí)細(xì)胞鮮重為接種時(shí)的2.89倍；第9天時(shí)達(dá)到接種時(shí)細(xì)胞鮮重的6.73倍；第12天時(shí)為接種時(shí)的12.54倍，到第15天時(shí)鮮重?zé)o明顯變化，細(xì)胞生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。

4、由此可以確定懸浮細(xì)胞的繼代周期10天較適宜。
　　利用高效液相色譜技術(shù)分析懸浮培養(yǎng)體系中的VB6的含量及存在形態(tài)，結(jié)果表明：云煙21懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液與懸浮細(xì)胞中的VB6含量依次為0.22μg/mL、3.28μg/g鮮重；培養(yǎng)液中各形式的構(gòu)成比為PMP7.58%、PM20.40%、PL1.96%、PN70.06%，培養(yǎng)液中幾乎不含PLP；懸浮細(xì)胞中各形式的構(gòu)成比為PMP0.76%、PM50.86%、PLP19.06%、PL16.13%