乳腺癌中P73α與Erα的相互調(diào)控.pdf

1、目的：探討乳腺癌細(xì)胞中ERα與p73α的相互調(diào)控。
　　 方法：感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自與北京Trans Gen公司。用Flag-ERα10ng及Flag-p73α10ng轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用LB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)過夜擴(kuò)增DNA，用天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取DNA，并進(jìn)行瓊脂糖膠電泳來檢測(cè)所提質(zhì)粒純度，用分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒濃度。用Flag-ERα及Flag-p73α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞。本研究的目的在于探測(cè)ERα與p73α

2、的相互作用，用DNA及空白載體按以下四組轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，四組DNA如下：6.5ug pcDNA3.0；2ug Flag-ERα+4.5ugpcDNA3.0；4.5ug Flag-p73α+2ug pcDNA3.0；2ug Flag-ERα+4.5ug Flag-p73α。MCF-7細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，用含10％胎牛血清的DMEM進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到大約60％時(shí)，用lipofection2000轉(zhuǎn)染試劑按照產(chǎn)品說明

3、書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。通過加用pcDNA3.0來確保每個(gè)盤中轉(zhuǎn)染的總的DNA量相等。細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后培養(yǎng)18-24小時(shí)，去掉培養(yǎng)基，PBS洗三次，加入細(xì)胞裂解液用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下，放在碎冰上，反復(fù)渦旋裂解細(xì)胞提取蛋白，并用Bradford法測(cè)595nm波長(zhǎng)來做出蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行蛋白定量。Western blot法檢測(cè)MCF-7中ERα、p73α蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.質(zhì)粒提取成功，DNA轉(zhuǎn)染成功，蛋白表達(dá)佳。2.ERα及p73