抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)與肺部免疫狀態(tài)的關(guān)系.pdf

1、在過去的三十年中，哮喘等變應(yīng)性疾病在世界范圍內(nèi)明顯增加。據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心研究顯示，美國哮喘發(fā)病率從 1980 年到1994年增加了75％，以0～4歲兒童增加最明顯，高達(dá)160％。我國兒童哮喘發(fā)病情況亦不容樂觀，0～14歲兒童哮喘患病率1990年到2000年 10 年間從0.78％上升到2.06％，增加了 1.6 倍。盡管遺傳因素與哮喘發(fā)生明確相關(guān)，由于人類遺傳背景短期內(nèi)不可能發(fā)生明顯變化，因此哮喘明顯增加可能是環(huán)境因素改變的結(jié)果

2、，這也正是“衛(wèi)生假說”的觀點。衛(wèi)生假說認(rèn)為在西方國家由于公共衛(wèi)生設(shè)施改善、疫苗及抗生素使用以及腸道菌群改變，使感染發(fā)生率降低，微生物對嬰幼兒正在發(fā)育的免疫系統(tǒng)刺激作用減弱，造成哮喘等變應(yīng)性疾病發(fā)生率大幅度升高。人類流行病學(xué)研究顯示，抗生素使用和腸道菌群改變與哮喘發(fā)病率升高相關(guān)。為了探討抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)和哮喘的關(guān)系，我們建立了抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)小鼠模型，在該模型上采用煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)，以探討抗生素所致腸道菌群失調(diào)與氣道變

3、應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)系，并進(jìn)一步在實驗性哮喘模型上了解腸道菌群失調(diào)對哮喘發(fā)作嚴(yán)重程度的影響以及在RSV感染動物模型上了解對RSV感染后肺部 T 輔助細(xì)胞極化方向的影響，評價抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)在哮喘等變應(yīng)性疾病發(fā)生中的作用，為哮喘的防治提供理論依據(jù)。 第一部分抗生素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)對免疫功能和Toll樣受體2、4基因表達(dá)的影響 目的：采用抗生素頭孢哌酮誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)，通過觀察小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫以及TLR2、4基因

4、表達(dá)變化，探討抗生素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)后對機(jī)體適應(yīng)性免疫和天然免疫的影響。 方法：60只4周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組：抗生素組和對照組，抗生素組小鼠連續(xù)7d口服頭孢哌酮，第7d經(jīng)口給予白色念珠菌。對照組用等量生理鹽水代替頭孢哌酮、白色念珠菌進(jìn)行實驗。第 8d 每組小鼠隨機(jī)取 10 只用于盲腸內(nèi)容物細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)、糞便含水量和體重變化的檢測，以了解腸道菌群失調(diào)情況。其余小鼠用于免疫功能檢測，包括脾指數(shù)、PHA誘導(dǎo)的脾臟淋

5、巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、抗體生成細(xì)胞數(shù)和PCR測TLR2、4 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：(1)抗生素組小鼠腸道內(nèi)腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌較對照組明顯減少，白色念珠菌增加，小鼠出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)伴糞便含水量增加和體重減輕；(2)抗生素組小鼠脾指數(shù)(0.0035±0.0002)較對照組(0.0055±0.0008)降低；(3)抗生素組 PHA 誘導(dǎo)的脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(0.0086±0.0016)較對照組(0.014

6、7±0.0020)減少；(4)抗生素組小鼠經(jīng)綿羊紅細(xì)胞攻擊后足跖增加的厚度(0.094±0.013mm)較對照組(0.152±0.021mm)少；(5)抗生素組小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)(0.193±0.004)較對照組(0.215±0.007)低；(6)脾臟的TLR2和TLR4基因表達(dá)水平較對照組下調(diào)。 結(jié)論：抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)后小鼠細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能以及TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)均降低，說明天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答

7、能力均降低，提示抗生素致腸道菌群失調(diào)對機(jī)體免疫功能有明顯影響。 第二部分抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)與變應(yīng)性氣道反應(yīng)的關(guān)系研究 目的：在抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠模型上采用煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)，誘導(dǎo)氣道變應(yīng)性反應(yīng)，探討抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)與氣道變應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)系。 方法：40只雌性BALB/c小鼠分為4組，每組10只。①抗生素組：口服頭孢哌酮7 d，第7d給予50μl白色念珠菌1次，9、16 d經(jīng)鼻給予50μl生理鹽

8、水；②激發(fā)組：1～7 d給予等量生理鹽水代替頭孢哌酮和白色念珠菌，9、16 d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應(yīng)原50μl；③抗生素加激發(fā)組：前7d處理同抗生素組，9、16 d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應(yīng)原50μl；④對照組：1～7 d給予等量生理鹽水代替頭孢哌酮和白色念珠菌，9、16 d經(jīng)鼻給予50μl生理鹽水。所有小鼠于第19d檢測BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)、細(xì)胞因子INF-γ和IL-4水平、肺部病理和轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet mRNA表達(dá)。

9、 結(jié)果：(1)激發(fā)組和抗生素加激發(fā)組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞增加，尤以抗生素加激發(fā)組小鼠更為明顯；(2)抗生素加激發(fā)組小鼠BALF中IL-4 (45.35±2.36pg/ml)水平較對照組(35.32+2.53 pg/ml)增加，IFN-γ水平無明顯變化；(3)4組小鼠肺組織病理學(xué)顯示均無明顯炎癥浸潤；(4)肺組織中轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA表達(dá)水平(0.57±0.023)比對照組(0.41±

10、0.020)高，T-bet/GATA-3比值(0.58±0.021)較對照組(0.80±0.035)降低。 結(jié)論：抗生素致腸道菌群失調(diào)小鼠經(jīng)過煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)，可致 Th2 優(yōu)勢的氣道變應(yīng)性反應(yīng)，提示抗生素致腸道菌群失調(diào)是誘發(fā)哮喘等變應(yīng)性疾病發(fā)生的危險因素。 第三部分抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)在實驗性小鼠哮喘模型上的效應(yīng)觀察 目的：采用OVA致敏和激發(fā)建立實驗性哮喘模型，在致敏階段用抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)，探討

11、抗生素致腸道菌群失調(diào)對哮喘發(fā)作嚴(yán)重程度的影響。 方法：54只小鼠分為3組，每組18只。哮喘組采用OVA致敏和激發(fā)；抗生素加哮喘組也采用 OVA 致敏和激發(fā)，在OVA致敏過程中加用抗生素和白色念珠菌誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)；對照組采用對照佐劑致敏和 PBS 激發(fā)，處理同哮喘組。激發(fā)結(jié)束后檢測BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)，ELISA 檢測細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4水平、肺組織病理評分以及流式細(xì)胞儀檢測肺部DC亞型和成熟度。 結(jié)果：

12、(1)經(jīng)過OVA致敏和激發(fā)，小鼠出現(xiàn)喘息癥狀，BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均較對照組顯著升高，IFN-γ，水平降低，IL-4水平升高，肺組織可見明顯炎癥，說明OVA致敏和激發(fā)建立的實驗性哮喘模型成功；(2)和哮喘組比較，抗生素加哮喘組小鼠喘息癥狀、BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)、IFN-γ和IL-4水平、肺部病理評分以及肺部DC亞型無顯著差異；肺部DC成熟度有顯著差異。 結(jié)論：抗生素誘導(dǎo)腸道菌群

13、失調(diào)在實驗性哮喘模型上對肺部DC成熟度有明顯影響，但抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)對肺部免疫狀態(tài)的影響很小，不足以影響哮喘發(fā)作的嚴(yán)重程度。 第四部分抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)在RSV感染小鼠模型上對肺部免疫狀態(tài)的影響 目的：在RSV感染小鼠模型上采用抗生素致腸道菌群失調(diào)后，煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)誘導(dǎo)氣道變應(yīng)性反應(yīng)，探討感染RSV后用抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)對RSV感染后肺部Th1/Th2極化方向的影響。 方法：54只：BALB

14、/c小鼠分為3組，每組18只。RSV組小鼠鼻腔接種RSV，感染后9d和16d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)；抗生素加RSV組小鼠鼻腔接種RSV后連續(xù)口服抗生素頭孢哌酮7d，感染后7d經(jīng)口給予白色念珠菌，感染后9d和16d進(jìn)行煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)。對照組小鼠鼻腔滴入等量病毒培養(yǎng)液，滴鼻后9d和16d進(jìn)行煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)。RSV感染后19d檢測BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)，ELISA 檢測細(xì)胞因子水平、肺組織病理評分以及流式細(xì)胞儀檢

15、測肺部DC亞型和成熟度。 結(jié)果：(1)小鼠感染RSV后，BALF接種到Hep-2細(xì)胞可以引起典型CPE，直接免疫熒光證實肺部有RSV抗原，BALF 中細(xì)胞總數(shù)升高，以淋巴細(xì)胞增加為主，肺部可見明顯炎癥，說明RSV感染小鼠模型建立成功；(2)與RSV組比較，抗生素加RSV組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)、IL-4、IL-10 和 IFN-γ,水平、肺部病理評分以及肺部 DC亞型和成熟度無顯著差別。 結(jié)論：抗生素誘導(dǎo)腸道菌