腸粘膜淋巴細胞對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的作用研究.pdf

1、本課題以多次低劑量口服CEP對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)BALB/c小鼠結(jié)腸炎的預(yù)防模型為基礎(chǔ)，利用流式細胞術(shù)檢測T細胞亞群CD8α+和TCRγδ+T細胞在腸相關(guān)淋巴組織及脾中的改變，探討T細胞亞群在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎中的作用以及T細胞亞群在口服耐受干預(yù)結(jié)腸炎中的作用，同時過繼轉(zhuǎn)移來自未處理小鼠或口服耐受處理小鼠的小腸上皮內(nèi)淋巴細胞(SI-IEL)及經(jīng)磁性活化細胞分選技術(shù)分選的SI-γδ IEL，觀察受體鼠結(jié)腸炎的癥狀及組織學(xué)病變，并初步探索細胞作

2、用的機制，為IBD的發(fā)病機制及臨床治療提供新的依據(jù)。
　　 第一部分：小鼠結(jié)腸炎的改善與結(jié)腸粘膜中CD8α+和TCRγδ+T細胞增多相關(guān)
　　 為建立BALB/c小鼠結(jié)腸炎，予7周齡雄性小鼠自由飲用4％DSS，每日監(jiān)測疾病活動指數(shù)，7日后取脾曲至肛門的腸段用于組織學(xué)評分。結(jié)果表明結(jié)腸炎小鼠的第7日疾病活動指數(shù)和組織學(xué)評分均較未處理對照鼠顯著升高。
　　 取結(jié)腸炎誘導(dǎo)7日后小鼠的結(jié)腸標本，制備結(jié)腸炎提取蛋白。以每只

3、200μl1.25 mg/ml CEP灌胃6周齡小鼠，隔日1次，共5次。以等濃度等量牛血清白蛋白灌胃為對照。于末次灌胃后休息3天開始用4％DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，評估兩組小鼠的疾病活動指數(shù)及病理學(xué)改變。從結(jié)腸炎誘導(dǎo)第4日至第7日，口服CEP結(jié)腸炎小鼠的DAI顯著低于口服BSA結(jié)腸炎小鼠。兩組的組織學(xué)評分具有顯著性差異，表明口服五次低劑量CEP能緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。Spearman分析顯示組織學(xué)評分與第7日疾病活動指數(shù)相關(guān)。
　　

4、收集未處理小鼠、結(jié)腸炎小鼠、口服CEP結(jié)腸炎小鼠、口服BSA結(jié)腸炎小鼠的血清，ELISA法檢測血清中TGF-β1和IFN-γ的濃度。結(jié)果示結(jié)腸炎小鼠血清中的TGF-β1濃度低于未處理鼠，與口服BSA對照鼠相比，口服CEP結(jié)腸炎小鼠血清中的TGF-β1有2至3倍的增加。然而，血清IFN-γ濃度在各組小鼠之間未見明顯差異。
　　 然后，我們重建結(jié)腸炎模型、口服CEP模型及對照組，提取小腸和大腸的上皮內(nèi)淋巴細胞、固有層淋巴細胞、脾細胞

5、、派氏集合淋巴結(jié)及腸系膜淋巴結(jié)的淋巴細胞，利用流式細胞術(shù)檢測各組小鼠中CD3+、TCRγδ+、CD8α+和CD8α+TCRγδ+T細胞的改變。
　　 與未處理組相比，結(jié)腸炎小鼠SI-IEL和SI-LPL的TCRγδ+和CD8α+TCRγδ+T細胞的比例增加，相應(yīng)的TCRγδ- T細胞和CD8α+TCRγδ- T細胞的比例降低。與口服BSA結(jié)腸炎對照組相比，口服CEP結(jié)腸炎小鼠LI-IEL和LI-LPL的TCRγδ+T細胞、CD8

6、α+TCRγδ+T細胞、CD8α+T細胞和CD8α+TCRγδ- T細胞的比例均增加，相應(yīng)的TCRγδ- T細胞和CD8α-TCRγδ- T細胞的比例降低。第7日的DAI與大腸粘膜中CD8α+T細胞或TCRγδ+T細胞的百分比之間呈負相關(guān)。
　　 口服CEP結(jié)腸炎小鼠的結(jié)果表明結(jié)腸炎的改善伴隨大腸粘膜淋巴細胞中CD8α+T細胞和TCRγδ+T細胞的增多，因此我們檢測DSS處理終止5日的修復(fù)期小鼠的腸粘膜淋巴細胞。與未處理對照組相

7、比，結(jié)腸炎修復(fù)期小鼠LI-IEL和LI-LPL的TCRγδ+T細胞、CD8α+TCRγδ+T細胞、CD8α+T細胞和CD8α+TCRγδT細胞的比例均增加，相應(yīng)的TCRγδ- T細胞和CD8α-TCRγδ- T細胞的比例降低。
　　 口服CEP結(jié)腸炎小鼠脾淋巴細胞中CD8α+T細胞的比例高于口服BSA結(jié)腸炎小鼠。PP的CD3+T細胞在結(jié)腸炎小鼠中的比例高于未處理鼠，CD8α+T細胞的比例亦增多，口服CEP結(jié)腸炎小鼠的PP中CD3

8、+T細胞和CD8α+T細胞的比例均低于口服BSA結(jié)腸炎小鼠。與PP中細胞的變化模式相反，MLN的CD3+T細胞在結(jié)腸炎小鼠中的比例低于未處理鼠，CD8α+T細胞的比例亦減少，口服CEP結(jié)腸炎小鼠的腸系膜淋巴結(jié)中CD3+T細胞和CD8α+T細胞的比例均高于口服BSA結(jié)腸炎小鼠。
　　 總之，口服多次低劑量CEP能緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，口服抗原致結(jié)腸炎的改善與大腸粘膜淋巴細胞中CD8α+T細胞和TCRγδ+T細胞的比例增多相關(guān)，修

9、復(fù)期粘膜的修復(fù)也伴隨大腸粘膜淋巴細胞中CD8α+T細胞和TCRγδ+T細胞比例的增多，提示腸粘膜CD8α+T細胞和TCRγδ+T細胞在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎中具有保護性調(diào)節(jié)作用?？诜褪苷T導(dǎo)脾淋巴細胞中CD8α+T細胞增多。PP與MLN中的T細胞在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎及口服耐受中發(fā)揮不同的作用。
　　 第二部分：小腸上皮內(nèi)γδ T細胞的提純
　　 γδT細胞在外周血及大多數(shù)淋巴器官中比例較少，但富集于上皮組織如腸上皮內(nèi)，該部分主要

10、建立BALB/c小鼠小腸上皮內(nèi)γδT細胞的提純過程。
　　 取BALB/c小鼠的小腸，外翻并振蕩，以離散上皮組織。在一部分實驗中，細胞懸液直接用40％/70％不連續(xù)Percoll離心，在另一部分實驗中，離散上皮首先用10ml的30％Percoll離心，去除大部分上皮細胞，然后用40％/70％不連續(xù)Percoll離心。利用兩步Percoll離心獲取SI-IEL的總過程耗時約2小時，而一步提純法則縮短半小時左右時間。對每組8份提取細

11、胞的分析顯示：一步40％/70％Percoll離心后純度約88.8％，兩步30％/40％/70％Percoll離心后純度約93.2％，兩組之間存在顯著性差異，污染的細胞主要為上皮細胞。然而在細胞量方面未見明顯差異，一步Percoll離心后細胞產(chǎn)量為0.81-1.48×107不等，平均1.141×107細胞，兩步Percoll離心后細胞產(chǎn)量為0.92-1.34×107不等，平均1.123×107細胞。利用三色流式細胞術(shù)檢測SI-IEL中C

12、D3+、TCRγδ+、CD8α+和CD8α+TCRγδ+T細胞的比例。SI-IEL主要由T細胞構(gòu)成，而且絕大多數(shù)是CD8α+T細胞。CD3+T細胞中，TCRγδ+T細胞占了較高的比例，大約占30-50％，TCRγδ+T細胞中大約90％是CD8α+的。兩種Percoll提純的細胞也被用于流式檢測，結(jié)果表明兩組之間細胞亞群的構(gòu)成無顯著差異。
　　 利用MACS分選兩步Percoll提純的SI-IEL中的γδT細胞。在這個過程中，抗體

13、和微珠的量需要經(jīng)過優(yōu)化處理，以獲得足夠的純度和產(chǎn)量。實驗結(jié)果顯示1.5×107細胞用3μg PE-conjugated anti-TCRδ-chain抗體染色，45ul anti-PE微珠分選能獲得95％以上的純度。經(jīng)包被的anti-CD3ε抗體刺激，SI-IEL比分選的γδ T細胞分泌更多的IFN-γ和TGF-β1，γδ T細胞產(chǎn)生中等量的TGF-β1和極少量的IFN-γ。
　　 總之，我們建立的SI-IEL分離程序是可依賴的

14、簡單的方法，獲得的細胞純度高及細胞量多。利用一步40％/70％ Percoll提純法可以少費力，足以用于細胞亞群的表型分析。先用10ml的30％ Percoll離心再用40％/70％ Percoll提純法獲得的細胞適合用MACS技術(shù)分選出γδ T細胞，從而為表型及功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分：小腸上皮內(nèi)淋巴細胞對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的保護作用
　　 為進一步研究SI-IEL及γδ T細胞對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎

15、的作用，來自未處理鼠、結(jié)腸炎鼠、口服CEP結(jié)腸炎鼠及口服BSA結(jié)腸炎鼠的SI-IEL3×106或SI-γδIEL9×105重懸在150μl PBS中，通過尾靜脈注射至受體鼠，以注射PBS作為空白對照組，然后受體鼠自由飲用4％ DSS7日以誘導(dǎo)結(jié)腸炎，評估受體鼠的DAI和組織學(xué)評分。結(jié)果顯示來自未處理小鼠及結(jié)腸炎小鼠的SI-IEL或分選的γδT細胞的轉(zhuǎn)移均能緩解受體鼠的結(jié)腸炎，來自口服CEP及BSA結(jié)腸炎小鼠的小腸上皮內(nèi)淋巴細胞或分選的γ

16、δ T細胞的轉(zhuǎn)移均能緩解受體鼠的結(jié)腸炎，來自口服CEP結(jié)腸炎鼠的SI-IEL的保護效果強于來自口服BSA結(jié)腸炎小鼠的SI-IEL。轉(zhuǎn)移各種SI-IEL的受體結(jié)腸炎鼠的DAI及組織學(xué)評分在第7日與轉(zhuǎn)移SI-γδ IEL的受體結(jié)腸炎鼠相比均有所減少，但未達到統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 經(jīng)包被的anti-CD3ε抗體刺激，來自口服CEP結(jié)腸炎鼠的SI-IEL和分選的γδT細胞比來自口服BSA結(jié)腸炎鼠的細胞分泌更多的TGF-β1。來自未處理鼠與

17、結(jié)腸炎鼠之間、來自口服CEP與口服BSA結(jié)腸炎鼠之間的SI-IEL和γδ T細胞分泌的IFN-γ無顯著差異。細胞轉(zhuǎn)移的受體鼠用于檢測血清中TGF-β1和IFN-γ的水平。與PBS對照組相比，細胞的轉(zhuǎn)移包括來自未處理鼠、結(jié)腸炎鼠、口服CEP結(jié)腸炎鼠、口服BSA結(jié)腸炎鼠的SI-IEL或分選的γδ T細胞，均引起受體鼠血清中TGF-β1水平提高2-3倍。血清TGF-β1的濃度與結(jié)腸炎體重下降百分比或組織學(xué)評分呈負相關(guān)。轉(zhuǎn)移口服CEP結(jié)腸炎鼠S

18、I-IEL的受體鼠比轉(zhuǎn)移口服BSA結(jié)腸炎鼠SI-IEL的受體鼠擁有更高濃度的TGF-β1。血清IFN-γ在細胞轉(zhuǎn)移受體鼠與PBS對照組之間均無明顯差異。體外培養(yǎng)顯示SI-IEL對anti-CD3ε抗體和Con A刺激均無明顯增殖。
　　 總之，SI-IEL及分選的γδ T細胞對DSS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠結(jié)腸炎具有保護作用，口服耐受加強了SI-IEL中調(diào)節(jié)細胞亞群的抑制效應(yīng)，包括γδ T細胞。TGF-β1最可能介導(dǎo)這一抑制效應(yīng)。