肝癌衍生生長(zhǎng)因子（HDGF）在胃癌的表達(dá)及其對(duì)胃癌AGS細(xì)胞影響機(jī)制的研究.pdf

1、胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,胃癌死亡居惡性腫瘤死亡的第二位.隨著近年外科技術(shù)的改進(jìn),早期胃癌術(shù)后5年生存率己達(dá)90﹪以上,然進(jìn)展期胃癌患者的5年生存率仍只有5﹪～15﹪,因此要提高胃癌的治療效果.降低胃癌死亡,除要提高早期胃癌的診斷率,還要發(fā)展新的更有效的治療手段.闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制,有助于篩選特異性的分子靶點(diǎn),對(duì)預(yù)防和降低胃癌發(fā)病有重要意義.胃癌多從癌前病變發(fā)展而來,de-novo癌直接從正常的黏膜發(fā)展而來.胃黏膜的癌變過程是

2、一個(gè)多因素、多步驟、內(nèi)外因交互并作用于正常胃干細(xì)胞,經(jīng)誘癌、促癌及演進(jìn)多階段的結(jié)果.對(duì)胃的各級(jí)癌前病變和癌組織的分子變化研究結(jié)果顯示,在胃粘膜上皮癌變多階段演進(jìn)過程中,發(fā)生許多不同的分子改變,存在癌基因的突變性激活和/或抑癌基因的雜合性缺失,從癌前病變到胃癌的演進(jìn)過程中還伴有DNA損傷修復(fù)基因的突變以及其他表基因改變.細(xì)胞的增殖異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的最早期事件. 肝癌衍生生長(zhǎng)因子(Hepatoma-derived growt

3、h factor,HDGF)是一種肝素結(jié)合的生長(zhǎng)因子,最初從人肝癌HuH-7細(xì)胞系無血清培養(yǎng)的上清液中分離得到.HDGF參與肝、腎、肺、血管等多種胚胎組織的生長(zhǎng)發(fā)育,在這些組織器官中高表達(dá),出生后表達(dá)明顯減低:HDGF具有有絲裂原作用,進(jìn)入細(xì)胞核經(jīng)核錨著后促進(jìn)胎肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等的增殖生長(zhǎng);HDGF也是一種旁分泌和自分泌生長(zhǎng)因子,促進(jìn)自身和鄰近細(xì)胞的增殖.還發(fā)現(xiàn)HDGF具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具

4、有促存活效應(yīng).近年研究示HDGF與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切.在鼠自發(fā)性肝細(xì)胞肝癌癌變演進(jìn)過程中,HDGF在癌變后表達(dá)明顯升高;HDGF在肝癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、胃癌等腫瘤組織中表達(dá)增高,且其表達(dá)與預(yù)后相關(guān).然迄今對(duì)HDGF參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子作用機(jī)制尚不明了.闡明HDGF參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子作用機(jī)制對(duì)進(jìn)一步的干預(yù)有意義. 本研究先采用免疫組織化學(xué)的方法研究HDGF在胃癌患者的胃癌組織及配對(duì)癌旁組織的表達(dá)情況,以評(píng)價(jià)HDG

5、F表達(dá)與胃癌臨床病理特征、胃癌演進(jìn)過程的關(guān)系和意義:然后構(gòu)建HDGF真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞,觀察高表達(dá)HDGF對(duì)AGS細(xì)胞生物學(xué)行為和細(xì)胞信息通路中關(guān)鍵分子活性的影響;最后用特異性siRNA"knockdown"HDGF后觀察對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響及其關(guān)鍵分子改變.以探討HDGF對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和其分子作用機(jī)制,HDGF作為胃癌診治靶點(diǎn)的可能性. 結(jié)果: 1.HDGF參與人胃癌的發(fā)生和演進(jìn)過程采用EnV

6、ision二步免疫組織化學(xué)的方法研究HDGF在205例胃癌患者的胃癌組織及配對(duì)癌旁組織的表達(dá),結(jié)果顯示細(xì)胞核HDGF的表達(dá)在胃黏膜的癌變進(jìn)程中是一個(gè)逐漸升高的過程,在胃的良性疾病淺表性胃炎、萎縮性胃炎的胃黏膜細(xì)胞核的HDGF不表達(dá)或表達(dá)很低,在胃癌的癌前病變腸上皮化生、不典型增生階段開始增高,P均<0.01;早期胃癌階段有進(jìn)一步增高,早期胃癌高于與腸上皮化生P<0.01,早期胃癌與不典型增生比較無差異,p=0.247;在進(jìn)展期胃癌比早期

7、胃癌更高,P<0.01.胃癌組織細(xì)胞核HDGF的表達(dá)與胃癌患者的有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、UICC分期相關(guān)(P<0.05),提示HDGF表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后相關(guān).結(jié)果表明HDGF表達(dá)在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期階段就可增高并與胃癌發(fā)生發(fā)展過程有關(guān). 2.高表達(dá)HDGF通過Erk1/2途徑促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞增殖觀察HDGF高表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,與AGS細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒的AGS細(xì)胞(pcDNA-AGS)

8、比較,穩(wěn)定表達(dá)HDGF的AGS細(xì)胞(HDGF-AGS)在無血清存在時(shí),其可維持細(xì)胞較明顯的增殖能力,P均<0.05;然而,在存在15﹪血清的情況卜,則三組細(xì)胞增殖無明顯差異,P均>0.05.用不同濃度的順鉑以抑制細(xì)胞增殖時(shí)發(fā)現(xiàn),HDGF-AGS細(xì)胞對(duì)順鉑更具抵抗性,而pcDNA-AGS細(xì)胞與空白AGS細(xì)胞無明顯差異.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與AGS細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒的AGS細(xì)胞比較,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HDGF后增加了MAPK

9、通路中總Erk1/2和磷酸化Erk1/2蛋白的表達(dá)水平,而對(duì)p38、JNK/SAPK的影響不明顯;轉(zhuǎn)染HDGF雖增加了總Akt的表達(dá)水平,然而磷酸化的Akt呈下調(diào)趨勢(shì):用ELISA法對(duì)細(xì)胞核蛋白分別檢測(cè)p65、p52、p50、Rei-B和ReI-C表明,三組細(xì)胞p65、p52、p50、Rel-B和ReI-C無顯著差異,P均>0.05.用Westen blot分析Bcl-2/Bcl-xl/Bad通路發(fā)現(xiàn)HDGF激活的Erk1/2并不活化B

10、cl-2/Bcl-xl/Bad通路.芯片檢測(cè)示HDGF上調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子T-box 18和b-LHL.用體外軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證穩(wěn)定表達(dá)HDGF的AGS細(xì)胞(HDGF-AGS)是否更具轉(zhuǎn)移潛能.結(jié)果發(fā)現(xiàn)(HDGF-AGS)細(xì)胞在體外軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中盡管細(xì)胞克隆形成數(shù)與對(duì)照的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒的AGS細(xì)胞和空白AGS細(xì)胞無明顯差異(P>0.05,ANOVA),但形成的細(xì)胞克隆團(tuán)較對(duì)照組大;在體外細(xì)胞侵襲實(shí)

11、驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)無論在無血清還是在15﹪血清情況下,通過Matrigel的細(xì)胞數(shù)在穩(wěn)定表達(dá)HDGF的AGS細(xì)胞、對(duì)照的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染peDNA3.1空質(zhì)粒的AGS細(xì)胞和空白AGS細(xì)胞無明顯差異(P>0.05,ANOVA). 3.沉默HDGF增加TRAF-2/c-IAP抑制性復(fù)合物而抑制胃癌AGS細(xì)胞的凋亡用特異性siRNA沉默HDGF后,AGS細(xì)胞在軟瓊脂克隆形成能力減弱.FCM分析發(fā)現(xiàn)沉默HDGF并不增加細(xì)胞的凋亡,然而在0.06125μg

12、/ml順鉑條件下,HDGF沉默組細(xì)胞顯示了明顯的凋亡抑制.進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)表明HDGF沉默AGS細(xì)胞增加了磷酸化Bel-2和Bad的表達(dá),而Bad Ser112和Ser136磷酸化水平與空白對(duì)照組和空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組比較無顯著差異.其他Bcl-2分子在HDGF沉默組和對(duì)照組之間表達(dá)無顯著差別.用TRAF2抗體進(jìn)行的免疫共沉淀檢測(cè)表明與空白對(duì)照組和空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組比較,HDGF沉默細(xì)胞能被TRAF2抗體"下拉"的c-IAP1

13、量更大,而TRAF2、c-IAP1和XIAP空白對(duì)照組和空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組比較,均無明顯改變. 結(jié)論: 1.細(xì)胞核HDGF表達(dá)在胃黏膜的癌變進(jìn)程中是一個(gè)逐漸增高的過程,HDGF表達(dá)在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期階段就可增高并與胃癌發(fā)生發(fā)展過程有關(guān),HIDGF的表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后相關(guān); 2.高表達(dá)HDGF通過Erk1/2途徑促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞增殖,但不增加AGS細(xì)胞的體外侵襲能力; 3.沉默HDGF表達(dá)抑制A