遺傳性癲癇大鼠海馬GABA能抑制性通路中相關(guān)基因的表達研究與機制探討.pdf

1、前言:
　　 氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Ccntral nervous system,CNS)數(shù)量最多,分布最廣的神經(jīng)遞質(zhì),在眾多的氨基酸中常見的神經(jīng)遞質(zhì)有γ-氨基丁酸(γ+aminobutyricacid,GABA),谷氨酸(Glutamate,Glu),甘氨酸(Glycine,Gly)和牛磺酸(Tamine,Tau)。根據(jù)對CNS作用的不同,氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)可分為兩類:興奮性氨基酸(Excitatory aminoacid,EA

2、A),主要包括Glu;抑制性氨基酸(Inhibitory amino acid,IAAl),包括GABA,Gly和Tau,其中主要是GABA。已有證據(jù)表明,腦中的許多氨基酸濃度在癲癇發(fā)作時發(fā)生了明顯的改變。突觸小體是一個游離的突觸前末端,它是腦組織在等滲溶液中勻漿時,神經(jīng)末梢在剪切力的作用下從軸突上斷裂下來,自發(fā)封閉形成的獨立結(jié)構(gòu)。據(jù)報道,突觸小體內(nèi)的氨基酸直接參與到神經(jīng)元信息的傳遞中,而且相對于全腦組織來說,突觸小體內(nèi)氨基酸濃度的改變

3、對癲癇發(fā)作的影響更相關(guān)。
　　 GABA是哺乳動物CNS中最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一,它能介導抑制性突觸傳遞作用。目前大量研究表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GABA能抑制作用減弱或缺乏是導致癲癇發(fā)生過程中神經(jīng)元興奮性增高的重要原因。
　　 突觸間隙中GABA降解的唯一途徑只能通過膜上的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運體(GAT)的重攝取來實現(xiàn)。GAT包括漿膜GAT和囊泡GAT(VGAT)。分子克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn),大鼠漿膜GAT包括四種轉(zhuǎn)運體亞型,即GA

4、T-1,GAT-2,GAT-3和GAT-4(或稱BGT-1)。目前有文獻證實GAT-1和GAT-3是海馬中含量最豐富的兩種GAT亞型,且最有可能通過調(diào)節(jié)突觸間隙中的GABA濃度從而導致癲癇的發(fā)生。
　　 配體門控的氯離子通道受體γ-氨基丁酸A型受體(GABAAR)可以調(diào)節(jié)絕大多數(shù)GABA能抑制性突觸傳遞作用。GABAAR是一種17個亞單位(包括α1-α6,β1-β4,γ1-γ4,δ,ε,π,θ及ρ1-ρ3)以不同方式組合形成的五

5、聚體離子通道結(jié)構(gòu),其中α1是成熟神經(jīng)元表達最多的亞單位之一,對于γ2來說,超過80%的GABAAR含有此亞單位。GABAAR不同亞單位組合可形成兩種不同的抑制,即時相抑制性突觸傳遞和緊張性外周突觸抑制,其中包含α1和γ2亞單位的受體主要位于突觸內(nèi)并且參與時相性突觸抑制,而包含α4亞單位的GABAAR主要定位于突觸外并且參與海馬的緊張性突觸抑制。此外,GABAAR介導的快速超極化抑制主要依賴于細胞內(nèi)的低Cl-濃度,鉀氯共轉(zhuǎn)運體二亞型(KC

6、C2)可以將神經(jīng)元內(nèi)Cl"轉(zhuǎn)運至胞外,從而產(chǎn)生GABAAR介導的超極化電流。
　　 星形膠質(zhì)細胞是一種非常常見的膠質(zhì)細胞,它在調(diào)節(jié)腦中的突觸傳遞中具有非常重要的作用。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細胞的一種主要成分,在癲癇發(fā)生過程中,GFAP蛋白表達的改變和星形膠質(zhì)細胞的病理性改變密切相關(guān)。
　　 遺傳性癲癇大鼠模型Tremor大鼠(TRM)出生8周后自發(fā)性地出現(xiàn)癲癇小發(fā)作,它的發(fā)作無需外加物理化學因素刺激,是研

7、究遺傳性癲癇的理想動物模型。迄今為止,還未見到應(yīng)用高效液相色譜儀(HPLC)測定TRM海馬突觸小體內(nèi)GABA,Glu,Gly和Tau含量的報道;有關(guān)TRM海馬內(nèi)GAT-1,GAT-3,GABAARα1,GABAARα4,GABAARγ2亞單位及KCC2的研究仍為空白。此外,盡管最近研究表明KCC2的表達在匹魯卡品誘導的癲癇模型和難治性癲癇患者中具有明顯改變,但是對于癲癇發(fā)生過程中KCC2改變的具體調(diào)節(jié)機制仍不清楚。同時,雖然目前有研究發(fā)

8、現(xiàn)癲癇發(fā)生過程中GFAP蛋白存在明顯的改變,但是對于癲癇相關(guān)的反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生的具體機制還不十分明確。因此,本研究擬采用RT-PCR,實時定量RT-PCR,免疫組化和免疫印跡技術(shù)研究TRM海馬中GAT-1和GAT-3在mRNA和蛋白層面的表達情況;同時采用實時定量RT-PCR和免疫印跡方法研究TRM海馬中GABAARRα1,GABAARα4,GABAARγ2亞單位及KCC2在mRNA與蛋白兩個層面的表達情況;此外,我們采用免疫熒光技術(shù)

9、、免疫組化技術(shù)和免疫印跡法研究TRM海馬中GFAP蛋白的分布與表達,以期明確GABA能抑制性突觸傳遞通路在癲癇發(fā)生中的角色與作用。
　　 實驗方法:
　　 一、突觸小體完整性檢測
　　 參照試劑盒說明書測定海馬突觸小體乳酸脫氫酶活性。
　　 二、HPLC分析
　　 二元梯度洗脫將海馬突觸小體中的氨基酸分離。峰面積進行定量。
　　 三、RT-PCR分析
　　 提取海馬總mRNA,參照

10、試劑盒說明書進行實時RT-PCR操作。分析平均光密度值確定GAT-1mRNA和GAT-3mRNA的相對表達。
　　 四、實時定量RT-PCR分析
　　 提取海馬總mRNA,參照試劑盒說明書進行實時定量RT-PCR。標準曲線法進行定量,檢測海馬GAT-1mRNA,GAT-3mRNA,GABAARα1mRNA,GABAARα4mRNA,GABAARγ2mRNA和KCC2mRNA表達。
　　 五、免疫熒光分析
　

11、　 免疫熒光技術(shù)對海馬各區(qū)(包括CA1、CA3和齒狀回(Dentategyrus,DG)區(qū))GFAP蛋白進行初步定位。
　　 六、免疫組化分析
　　 腦組織進行常規(guī)做冰凍切片。用圖像分析系統(tǒng)測定各組海馬CA1,CA3與DG區(qū)GAT-1、GAT-3和GFAP免疫反應(yīng)的平均光密度值。
　　 七、免疫印跡分析
　　 提取海馬組織總蛋白,ECL顯影后分析GAT-1,GAT-3,GABAARα1,GABAARα4

12、,GABAARγ2,KCC2和GFAP蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 一、海馬突觸小體的完整性檢測
　　 海馬突觸小體的完整性用乳酸脫氫酶的活性來評價。正常組在溫育前后,海馬突觸小體懸液中乳酸脫氫酶活性顯著高于上清液中乳酸脫氫酶活性(beforeincubation:25.87±1.41 in suspension of control rats vs 5.26±0.91 in supematant of co

13、ntrolrats,p＜0.01:afterincubation:26.18±1.25 in suspension of control rats vs5.4±0.85i nsupematant of controlrats,p＜0.01),且比例均維持在約5:1不變;此外,TRM組在溫育前后,海馬突觸小體懸液中乳酸脫氫酶活性也顯著高于上清液中乳酸脫氫酶活性(before incubation:26.75±1.63insuspensio

14、n of TRMsvs 5.08±1.05 insupcrnatant of TRMs,p＜0.01;afterincubation:26.93±1.36insuspension of TRaMsvs5.21±1.17insupematant of TRMs,p＜0.01),且比例也都維持在約5:1不變。
　　 二、HPLC測定結(jié)果
　　 TRM海馬突觸小體內(nèi)的Glu含量明顯高于正常組(132.33±2.00inTRMs

15、vs107.90±3.98incontrolrats,p＜0.01);而對于GABA,Gly和Tau來說,其在TRM海馬突觸小體內(nèi)的含量均明顯低于正常組(GABA:59.55±6.38inTRMsvs102.36±21.90incontrolrats,p＜0.01;Gly:1139.85±76.50inTRMsvs1345.49±115.25incontrolrats,p＜0.01;Tau:70.79±2.01inRMsvs107.72

16、±2.41 incontrolrats,p＜0.01)。
　　 三、RT-PCR結(jié)果
　　 GAT-1mRNA在TRM海馬中的表達明顯高于正常大鼠(0.72±0.13inTRMsvs0.43±0.04incontrolrats,P＜0.01);此外,與正常組比較,TRM海馬中GAT-3mRNA的表達也顯著增加(0.83±0.17inTRMsvs0.61±0.04incontrolrats,P＜0.05)。
　　

17、四、實時定量RT-PCR結(jié)果
　　 TRM海馬GAT-1mRNA的表達顯著高于正常對照組(1.58±0.42inTRMsvs0.45±0.33incontrolrats,P＜0.01);此外,相對于正常組來說,GAT-3mRNA在TRM海馬中的表達也明顯增加(1.40±0.13inTRMsvs0.77±0.29incontrolrats,P＜0.05);TRM海馬中GABAARα1mRNA和GABAARα4mRNA的表達均顯著高

18、于正常大鼠(GABAARα1:2.0±0.57inTRMsvs0.90±0.41incontrolrats,P＜0.01;GABAARα4:1.74±0.43inTRMsvs0.74±0.22incontrolrats,P＜0.01);但是,GABAARγ2mRNA和KCC2mRNA在TRM海馬中的表達均顯著低于正常對照組(GABAARγ2:0.63±0.10inTRMsvs1.64±0.23incontrolrats,P＜0.01;K

19、CC2:0.75±0.16inTRMsvs1.88±0.36incontrolrats,P＜0.01)。
　　 五、免疫熒光結(jié)果
　　 GFAP蛋白在TRM和正常大鼠海馬CA1,CA3和DG區(qū)均有表達。
　　 六、免疫組化結(jié)果
　　 GAT-1蛋白在正常大鼠和TRM海馬的CA1,CA3和DG區(qū)中均有明顯分布,且在TRM海馬的CA1,CA3和DG區(qū)中的整合光密度值均比在正常大鼠中明顯;而對于GAT-3來說,

20、只在大鼠海馬的CA1區(qū)中表達豐富,在海馬的CA3區(qū)和DG區(qū)只有微弱的表達,同時,和正常大鼠比較,TRM海馬CA1區(qū)中GAT-3蛋白的整合光密度值明顯增加;GFAP蛋白免疫反應(yīng)性的陽性細胞在正常大鼠和TRM海馬CA1,CA3和DG區(qū)均有表達。TRM海馬CA1,CA3和DG區(qū)的GFAP蛋白免疫反應(yīng)性的整合光密度值均顯著高于正常組。
　　 七、免疫印跡結(jié)果
　　 TRM海馬中GAT-1蛋白的表達顯著高于正常大鼠(0.64±0.

21、06 inTRMsvs0.32±0.10 incontrolrats,P＜0.01);此外,TRM海馬中GAT-3蛋白的表達也顯著高于正常組(0.94±0.06inTRMsvs0.51±0.15inconntrolrats,P＜0.01)。綜上,TRM海馬中GAT-1和GAT-3蛋白表達確實上調(diào)。TRM海馬中GABAARα1和GABAARα4蛋白的表達均顯著高于正常大鼠(GABAARα1:0.75±0.08inTRMsvs0.44±0.

22、05incontrolrats,P＜0.01;GABAARα4:1.13±0.04inTRMsvs0.77±0.06 incontrolrats,P＜0.01);然而,GABAARγ2和KCC2蛋白在TRM海馬中的表達均顯著低于正常組(GABAARγ2:0.85±0.01inTRMsvs1.19±0.05incontrolrats,P＜0.01;KCC2:1.38±0.10inTRMsvs1.84±0.09incontrolrats,P

23、＜0.01);與此同時,TRM海馬中GFAP蛋白的表達顯著高于正常組(1.26±0.17inTRMsvs0.82±0.13incontrolrats,p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、首次應(yīng)用HPLC法同時測定TRM海馬突觸小體內(nèi)GABA、Glu、Gly和Tau的含量。TRaM中GABA和Tau顯著降低及Glu顯著增加,可能會促進神經(jīng)元興奮性增加,引發(fā)癲癇樣放電;而TRM中Gly顯著降低,可能是癲癇發(fā)生后的一種代

24、償性保護機制。
　　 2、首次證實,與正常對照組比較,TRM海馬GAT-1和GAT-3在mRNA和蛋白水平表達上調(diào)。
　　 3、首次證實,與正常對照組比較,TRM海馬GABAARα1和GABAARα4,在mRNA和蛋白水平表達上調(diào);TRM海馬GABAARγ2和KCC2在mRNA和蛋白水平表達下調(diào)。
　　 4、首次證實TRM海馬GFAP蛋白顯著上調(diào),提示癲癇的發(fā)生過程中,可能存在星形膠質(zhì)細胞增生的現(xiàn)象。
　　

25、 5、TRM海馬GAT-1和GAT-3在mRNA與蛋白水平表達上調(diào),可能會促進神經(jīng)元興奮性增加,引發(fā)癲癇樣放電,進而構(gòu)成TRM癲癇表型的發(fā)作基礎(chǔ)。
　　 6、TRM海馬GABAARα1和GABAARα1在mRNA與蛋白水平表達上調(diào),可能會抑制神經(jīng)元的興奮性,提示可能是癲癇發(fā)生后的一種代償性保護機制;TRM海馬GABAARγ2和KCC2在mRNA與蛋白水平表達下調(diào),可能會促進神經(jīng)元興奮性增加,引發(fā)癲癇樣放電,進而構(gòu)成TRM癲癇表