siRNA封閉IGFIR蛋白表達治療肝癌的實驗研究.pdf

1、957399例犬博士學(xué)位論文(2006屆)siRNA封閉IGFIR蛋白表達治療肝癌的實驗研究HumanIGFIRGeneTherapyofLiverCancerMediatedbys譴tNA研究生姓名指導(dǎo)教師姓名專業(yè)名稱研究方向論文提交日期牛堅錢海鑫(教授)普通外科學(xué)肝癌的基礎(chǔ)與臨床2006年4月sil孫A封閉IGFIR蛋白表達治療肝癌的實驗研究中文提要IGFIRmRNA表達水平為1059士68，無瘤栓組為435士38；肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組IGF

2、IRmRNA表達水平為1203：t63，無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組為506：1：46，相應(yīng)的兩組之間有顯著差異。此結(jié)果表明IGFIRmRNA表達水平增高與臨床上腫瘤的侵襲特性有關(guān)。2采用免疫組化法檢測IGFIR蛋白在24例標本中的表達發(fā)現(xiàn)在667％(16／24例)的肝癌組織內(nèi)可見到IGFIR陽性表達，IGFIR陽性表達顆粒主要位于胞膜和胞漿，在同一組織標本中IGFIR表達呈現(xiàn)均一性。IGFIR的表達在不同分化程度的肝癌有顯著差異(P005)。3利用R

3、TPCR技術(shù)檢測IGFIR基因在14株肝癌細胞株中的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞株IGFIR的明顯表達。胎肝細胞系：L02沒表達。Westernblot顯示14株肝癌細胞株中IGFIR蛋白表達均為陽性，在105KD處可見到清晰的蛋白陽性表達條帶。但在sK、Hep3B表達較弱。通過細胞免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)IGFIR陽性表達顆粒主要位于肝癌細胞SMMC7721胞膜和胞漿，表達呈現(xiàn)均一性。由此可見，IGFIR在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制I

4、GFIR基因的表達將起到控制腫瘤生長的目的。第二部分封閉人肝癌IGFIR的siRNA片段設(shè)計、篩選、真核表達載體的構(gòu)建及SMMC7721細胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化l在哺乳動物細胞的siRNA研究中，有兩個關(guān)鍵的步驟，即如何篩選出最有效的針對目標基因的siRNA片段，并使其高效轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞內(nèi)和表達。本實驗通過wwwambiontom網(wǎng)站的siRNA設(shè)計軟件，設(shè)計針對IGFIR的特異性siRNA。2質(zhì)粒的擴增、提取及鑒定：采用DH5大腸桿菌為

5、工作菌，制備感受態(tài)細胞，擴增質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA，并經(jīng)酶切鑒定以備轉(zhuǎn)染使用。3轉(zhuǎn)染效率與脂質(zhì)體的量和質(zhì)粒量存在交互作用。在24孔板中以Lipofectarnine200031tl，質(zhì)粒量10ug時轉(zhuǎn)染效率最高，達到95％以上。在24孔板中，以LipofectamineReagentPlusl5p1，質(zhì)粒量0Bug時轉(zhuǎn)染效率最高，達到65％。對數(shù)生長期的5106細胞來說，電壓200V，電容700／aF，質(zhì)粒4ug時，轉(zhuǎn)染效率最高68％。L