siRNA抑制IL-1RⅠ和CDK2表達(dá)治療RA的實(shí)驗研究.pdf

1、研究背景和目的： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)是常見的以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，病變亦可以累及全身組織器官，病程長，病情反復(fù)發(fā)作，復(fù)雜多變，治療困難，預(yù)后較差。本病任何年齡均可發(fā)病，多發(fā)于30～60歲之間，45歲左右最常見，隨年齡增長，發(fā)病率也增高，女性發(fā)病率明顯高于男性，據(jù)統(tǒng)計我國的患病率約為0.32％~0.36％。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病起計10年內(nèi)約有600的患者會致殘

2、，是造成我國人群喪失勞動力和致殘的主要病因之一。 方法： 第一部分：運(yùn)用ELISA方法定量檢測RA患者外周血及關(guān)節(jié)液IL-1RI、IL-1β及CDK2水平，并對檢測結(jié)果進(jìn)行ROC分析以及診斷效能評價，以明確上述三種指標(biāo)對不同炎癥性疾病患者的診斷價值，并選取最佳項目用于臨床診斷。 第二部分：選擇對RA特異的IL-1RI和CDK2基因，設(shè)計其siRNA，并構(gòu)建兩者的siRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人成纖維滑膜細(xì)胞，檢測其抑

3、制IL-1RI及CDK2表達(dá)的效果，并用CCK-8評價慢病毒包裝的IL-1RI和CDK2siRNA對滑膜細(xì)胞生長的影響。 第三部分：將構(gòu)建的IL-1RI和CDK2慢病毒載體聯(lián)合或獨(dú)立轉(zhuǎn)染至CIA小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)，觀察不同分組CIA小鼠的治療效果。 結(jié)果： 第一部分：IL-1RI、IL-1β或CDK2各組間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。對IL-1RI而言，RA患者組與RA患者關(guān)節(jié)液組、SLE患者組、急性上呼吸道感染組

4、、對照組(含SLE患者、急性上呼吸道感染患者和健康體檢者)、健康體檢組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；對CDK2而言，RA活動期與RA緩解期，RA患者組與RA患者關(guān)節(jié)液組、SLE患者組、急性上呼吸道感染組、對照組、健康體檢組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；對IL-1β而言，RA活動期與RA緩解期，RA患者組與RA患者關(guān)節(jié)液組、健康體檢組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 RA患者活動期和緩解期比較CDK2的R

5、OC曲線下面積最大，其余依次為IL-1β、IL-1RI；RA患者組與SLE患者比較CDK2曲線下面積最大，其次為IL-1RI；RA患者組與急性上呼吸道感染患者組比較IL-1RI曲線下面積最大，其次為CDK2；RA患者組與對照組比較CDK2曲線下面積最大，其次為IL-1RI。 RA活動期患者組與RA緩解期患者組比較，CDK2的診斷敏感度和特異度分別為91％和53％，IL-1β的診斷敏感度和特異度分別為21％和88％，而CDK2+I

6、L-1β并聯(lián)聯(lián)合診斷敏感度和特異度分別為93％和47％。RA患者組與SLE患者組比較，并聯(lián)診斷試驗CDK2+IL-1RI敏感度和特異度分別為94％和47％，串聯(lián)試驗CDK2+IL-1RI敏感度和特異度分別為43％和96％。RA患者組與急性上呼吸道感染患者組比較，并聯(lián)聯(lián)合診斷CDK2+IL-1RI敏感度和特異度分別為74％和90％。RA患者組與對照組比較，IL-1β的敏感度和特異度分別96％和11％，IL-1RI的敏感度和特異度分別49％

7、和99％；CDK2+IL-1RI+IL-1β并聯(lián)聯(lián)合診斷的敏感度和特異度分別為100％和5％，串聯(lián)聯(lián)合診斷的敏感度和特異度分別為35％和100％。 第二部分：RNAi慢病毒IL-1RI基因相對表達(dá)量結(jié)果顯示正常對照組、慢病毒對照組、R4組分別與R2組、R2+R4組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，R2組與R2+R4組兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；RNAi慢病毒CDK2基因相對表達(dá)量結(jié)果顯示正常對照組、慢病毒對照

8、組分別與R4組、R2組、R2+R4組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，R4組、R2組、R2+R4組兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。IL-1RI、IL-1β和CDK2在24h或72h檢測結(jié)果空白上清液組與轉(zhuǎn)染對照，R4上清液與R2上清液均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而其他組間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；R4上清液或R2上清液IL-1RI、IL-1β和CDK2在24h與72h檢測結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CCK-

9、8評價IL-1RI及CDK2siRNA慢病毒干擾滑膜細(xì)胞生長結(jié)果顯示正常對照組、慢病毒對照組分別與R2組、R2+R4組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 第三部分：初次造模之后第14天小鼠出現(xiàn)跛行，4只小鼠死亡，小鼠體重范圍13～17g；第21天第二次注射后跛行、后腿紅腫癥狀加重，沒有老鼠死亡.100只小鼠有78只造模成功(成功率78％)；治療后CIA小鼠病理學(xué)結(jié)果顯示正常對照組：膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞排

10、列整齊，軟骨表面光滑，關(guān)節(jié)腔內(nèi)未見滲出液；CIA小鼠未治療組：膝關(guān)節(jié)及周圍有大量中性粒細(xì)胞浸潤，滑膜呈現(xiàn)增生趨勢，軟骨及骨骼有炎性改變；治療組較CIA小鼠未治療組病理改變輕。CIA小鼠外周血IL-1RI各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(PIL-IRI<0.001)，IL-1β、CDK2均無統(tǒng)計學(xué)意義(PIL-1β=0.871，PCDK2=0.078)；CIA小鼠外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+和CD8+各組間均有統(tǒng)計學(xué)意義(FCD3=7.646，P

11、<0.001；FCD4=4.395，P<0.001；FCD8=3.866，P<0.001)：RT-PCR結(jié)果CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞IL-1RI或CDK2基因RNA表達(dá)水平各組間均有統(tǒng)計學(xué)意義(FIL-IRI=52.833，P<0.001，F(xiàn)CDK2=68.440，P<0.001). 結(jié)論： 第一部分：IL-IRI對RA的診斷效能次于CDK2：但可有效的區(qū)分RA與急性上呼吸道感染。CDK2對RA的診斷效能較高；用于RA活動

12、期與緩解期、RA與SLE的鑒別診斷效能較高；對于RA與急性上呼吸道感染鑒別診斷次于IL-1RI。單個項目IL-1RI對RA具有診斷價值，IL-1β對RA具有早期診斷價值；CDIC2+IL-1RI+IL-1β串聯(lián)聯(lián)合診斷可以提高RA的診斷價值，并聯(lián)聯(lián)合診斷可以提高RA的早期診斷價值。 第二部分：成功培養(yǎng)出人RA關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞，并成功構(gòu)建IL-1RI及CDK2特異性siRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人FLS細(xì)胞可明顯抑制IL-1RI及C

13、DK2表達(dá)；瞬時轉(zhuǎn)染后RT-PCR結(jié)果顯示，R2干擾IL-1RI基因表達(dá)效果較好，R4干擾CDK2基因表達(dá)效果較好。提示IL-1RI、CDK2基因沉默F(xiàn)LS細(xì)胞有望成為減輕炎癥、延緩纖維化治療RA的新方法。 第三部分：成功建立小鼠CIA模型，將IL-1RI及CDK2特異性siRNA慢病毒載體聯(lián)合或獨(dú)立轉(zhuǎn)染CIA小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)可抑制IL-1RI及CDK2表達(dá)并緩解小鼠關(guān)節(jié)炎癥。說明IL-1RI、CDK2RNAi慢病毒載體治療CIA小鼠

14、有一定療效，但其確切機(jī)制和完善的研究方法需要進(jìn)一步研究，可為今后采取體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法實(shí)施人類RA的基因治療提供實(shí)驗依據(jù)。 主要創(chuàng)新點(diǎn)： 1.通過ROC曲線分析及診斷效能評價方法，并根據(jù)臨床診療的不同需要為RA患者選擇最佳診斷效能的評價指標(biāo)。單個項目IL-1RI對RA具有診斷價值，IL-1β對RA具有早期診斷價值；CDK2+IL-1RI+IL-1β串聯(lián)聯(lián)合診斷可以提高RA的診斷價值，并聯(lián)聯(lián)合診斷可以提高：RA的早期診斷價值