α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)誘發(fā)高致瘤性干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究α-KG類(lèi)似物α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）誘發(fā)高致瘤性干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制。
　　方法：通過(guò)體外常氧或缺氧條件下的細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用細(xì)胞集落形成試驗(yàn)、臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)、三磷酸腺苷(ATP)定量試驗(yàn)、乳腺細(xì)胞球形成試驗(yàn)、報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建及雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法、Western分析、小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、半定量巢式RT-PCR、

2、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、免疫熒光染色和成像及流式細(xì)胞術(shù)、以及體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行腫瘤異體移植等技術(shù)手段，研究DM-2KG對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用。
　　結(jié)果：⑴α-KG作為PHDs的輔助因子，可激活PHDs，促進(jìn)HIF-1α的降解，但是具有跨膜滲透能力的DM-2KG區(qū)別于另一種α-KG類(lèi)似物octyl-2KG，其在常氧條件下，不僅沒(méi)有促進(jìn)HIF-1α的降解，反而特異性提高HIF-1α蛋白水平，并能進(jìn)一步激發(fā)HIF-1

3、α下游目標(biāo)基因，如GLUT1、VEGF和PDK1等的表達(dá)。⑵DM-2KG是通過(guò)抑制HIF-1α蛋白的降解環(huán)節(jié)而上調(diào)其表達(dá)水平。⑶DM-2KG促進(jìn)HIF-1α蓄積是通過(guò)抑制PHD2介導(dǎo)的HIF-1αPro564羥基化實(shí)現(xiàn)的。⑷DM-2KG可以通過(guò)誘導(dǎo)p21基因表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘發(fā)產(chǎn)生具可逆性生長(zhǎng)的靜止期癌細(xì)胞。⑸經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)周期DM-2KG培養(yǎng)后，DM-2KG還可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44，從而使這類(lèi)癌細(xì)胞具備干

4、細(xì)胞的表型。⑹經(jīng)DM-2KG預(yù)處理后的MDA-MB-231細(xì)胞的體外和體內(nèi)的成瘤能力均明顯增強(qiáng)，這組細(xì)胞符合腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性。⑺當(dāng)用shRNA敲減乳腺癌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)后，p21和CD44表達(dá)、DM-2KG誘發(fā)的高致瘤性均將受抑制，提示DM-2KG誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞的靜止期和干細(xì)胞樣表型具有HIF-1α依賴性的特點(diǎn)。
　　結(jié)論：DM-2KG可以通過(guò)抑制PHD2功能，上調(diào)HIF-1α蛋白水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，并誘發(fā)產(chǎn)生