腦積水動(dòng)物蛛網(wǎng)膜絨毛內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能改變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的腦積水是神經(jīng)外科多發(fā)疾病，盡管腦脊液分流手術(shù)和三腦室造瘺的手術(shù)廣為開展，但總體治療效果仍然不佳。以美國2000年的橫斷面調(diào)查為例，全年5574例接受分流手術(shù)的病人中，40.7％的病人是因?yàn)樵瓉淼姆至髡系K而需要進(jìn)行再次手術(shù)。要解決腦積水的問題，需要研究腦脊液的分泌、循環(huán)、吸收三個(gè)環(huán)節(jié)。這三個(gè)環(huán)節(jié)彼此有何相互影響?例如，在腦脊液循環(huán)過程中某處造成梗阻，是否會(huì)對腦脊液的吸收功能造成繼發(fā)改變?基于這種思路，本研究擬在構(gòu)建成年犬腦積水動(dòng)

2、物模型的基礎(chǔ)上，首先研究蛛網(wǎng)膜絨毛的顯微結(jié)構(gòu)，以及腦積水狀態(tài)下上矢狀竇周圍的蛛網(wǎng)膜絨毛形態(tài)改變，CD31和vonWillebrand因子的特異性表達(dá)變化，了解腦積水以后蛛網(wǎng)膜絨毛內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)有無變化。然后通過蛛網(wǎng)膜下腔注射同位素示蹤劑的方法，了解蛛網(wǎng)膜絨毛對腦脊液的吸收功能在不同時(shí)段的的變化。以期對于腦積水狀況下的蛛網(wǎng)膜顆粒繼發(fā)的病理生理改變和功能變化做出說明，并為下一步研究和腦積水的治療方案的選擇提供思路。 材料與方法

3、 本實(shí)驗(yàn)第一部分重點(diǎn)觀察腦積水后的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。采用26只雜種犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2只用于蛛網(wǎng)膜顆粒的HE染色研究，另外24支動(dòng)物隨機(jī)分為4組，第1組為假手術(shù)對照組，枕大池中注射生理鹽水。第2、3、4組為腦積水組(急性期組、亞急性期組和慢性期組)，手術(shù)做犬寰枕部直切口，切開寰枕筋膜，根據(jù)0.3ml/kg的劑量在枕大池-第四腦室內(nèi)注入Fluid200型硅油(10,000c.s.)。術(shù)后對實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行行為學(xué)觀察和Tarlov神經(jīng)功能評分。

4、第2、3、4組動(dòng)物分別在手術(shù)后3天、2周、12周處死，處死前經(jīng)磁共振頭顱掃描驗(yàn)證腦積水的發(fā)展情況并精確測量腦室相關(guān)徑線，進(jìn)行各組間對比。2只HE染色組動(dòng)物經(jīng)雙側(cè)頸動(dòng)脈灌注4％甲醛后取材，石蠟包埋，從前到后軸位間隔0.5mm連續(xù)切片，每張切片厚0.6μm，在光鏡下觀察采集圖片。在各組動(dòng)物中各取一只，經(jīng)雙側(cè)頸動(dòng)脈灌注2％的戊二醛后取材，經(jīng)固定、修塊后進(jìn)行50nm的超薄切片，電子顯微鏡下觀察、照相。各組動(dòng)物中各取5只，經(jīng)雙側(cè)頸動(dòng)脈灌注Zamb

5、oni液(含2％多聚甲醛，15％苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液，pH值7.4)后取材，做冰凍切片后分別進(jìn)行CD-31，vonWillebrand因子的免疫熒光組織化學(xué)染色，并對蛛網(wǎng)膜絨毛表面內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 本實(shí)驗(yàn)的第二部分測量腦積水后蛛網(wǎng)膜絨毛吸收功能的改變。將20只成年雜種犬隨機(jī)分成4組。實(shí)驗(yàn)組(第2、3、4組)仍按第一部分方法構(gòu)建腦積水模型，假手術(shù)對照組為第1組。假手術(shù)對照組在手術(shù)后1周，急性期組在手

6、術(shù)后3天，亞急性期組在手術(shù)后2周，慢性期組在手術(shù)后12周分別行阻塞篩板的手術(shù)，然后在顱內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注射1ml含有50μCi3H2O的生理鹽水。注射后解剖頸總靜脈，分別在注射后1小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、48小時(shí)采血。血樣經(jīng)血清析出并處理后，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測量放射性同位素含量。根據(jù)上述結(jié)果繪制各組的平均吸收曲線。另外，繪制每只動(dòng)物的吸收曲線后，計(jì)算1-48小時(shí)內(nèi)的曲線下面積(AUC)，作為該動(dòng)物經(jīng)蛛網(wǎng)膜絨毛吸收腦脊液能力的參考。

7、各組動(dòng)物AUC值采用方差分析進(jìn)行比較。 結(jié)果 (1)通過在犬枕大池-四腦室內(nèi)注射硅油的方法，我們成功的構(gòu)建了腦積水動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)犬在手術(shù)后急性期(1～3天內(nèi))表現(xiàn)出反應(yīng)遲鈍，對外界刺激表現(xiàn)淡漠，少食或拒食拒飲，嗜睡等癥狀。術(shù)后各組Tarlov評分結(jié)果提示正常對照組與腦積水組(第2、3、4組)評分結(jié)果有顯著性差異。 (2)術(shù)后分時(shí)段頭顱磁共振結(jié)果顯示各腦積水組動(dòng)物腦室隨時(shí)間而表現(xiàn)出進(jìn)行性擴(kuò)大的趨勢。在慢性期，腦室極

8、度擴(kuò)大，大腦皮質(zhì)萎縮。(3)犬蛛網(wǎng)膜絨毛主要分布于上矢狀竇中份偏前的位置，與中央靜脈回流至上矢狀竇的位置吻合。 (4)犬蛛網(wǎng)膜絨毛HE染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：犬蛛網(wǎng)膜絨毛具有最外層的內(nèi)皮細(xì)胞層，其下的纖維囊，蛛網(wǎng)膜細(xì)胞層(杯細(xì)胞叢)，以及中央核。有的絨毛呈球形，有的則以分葉狀或是匍匐式生長，形態(tài)極不規(guī)則。還有一些則是表面的纖維囊極不發(fā)達(dá)，幾乎是蛛網(wǎng)膜細(xì)胞層緊貼著內(nèi)皮細(xì)胞層。 (5)使用anti-CD31免疫熒光組織化學(xué)染色的結(jié)果

9、顯示：在整個(gè)靜脈竇內(nèi)皮細(xì)胞上，都顯示陽性。包括蛛網(wǎng)膜絨毛表面的內(nèi)皮細(xì)胞，其顯色強(qiáng)度與竇內(nèi)皮細(xì)胞無異。方差分析的結(jié)果顯示四組動(dòng)物之間蛛網(wǎng)膜絨毛內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)差異無顯著性。 (6)vonWillebrand因子的免疫熒光組織化學(xué)染色則表明：在正常3犬對照組，蛛網(wǎng)膜絨毛頂端內(nèi)皮細(xì)胞的vonWillebrand因子的表達(dá)較竇壁內(nèi)皮細(xì)胞明顯減弱。各組間方差分析的結(jié)果顯示各組動(dòng)物蛛網(wǎng)膜絨毛表面內(nèi)皮細(xì)胞vonWillebrand因子表達(dá)

10、差異有顯著性，亞急性期與慢性期腦積水蛛網(wǎng)膜絨毛表面內(nèi)皮細(xì)胞vonWillebrand因子表達(dá)較正常組和急性期組增強(qiáng)。 (7)第二部分的功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：注射入犬蛛網(wǎng)膜下腔的氚水的吸收呈現(xiàn)出偏態(tài)分布的單峰曲線的特征。在正常組與急性期組以及亞急性期組，靜脈血中的氚水含量在8小時(shí)的時(shí)候達(dá)到高峰，隨后緩慢下降。慢性期組動(dòng)物的靜脈血液中氚水的含量在16小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰，峰值較正常對照組顯著降低。對各組動(dòng)物吸收曲線下面積(AUC)進(jìn)行方差分析后發(fā)

11、現(xiàn)，①正常對照組、急性期組和亞急性期組三組彼此之間，無顯著性差異；②在正常對照組與慢性期組間，數(shù)據(jù)存在顯著性差異；③在急性期組和慢性期組間，數(shù)據(jù)存在顯著差異；④在亞急性期組和慢性期組之間，數(shù)據(jù)存在顯著差異。慢性期組AUC值明顯下降。 結(jié)論 (1)犬蛛網(wǎng)膜絨毛與人蛛網(wǎng)膜顆粒具有基本相同的層次結(jié)構(gòu)(同樣具有內(nèi)皮細(xì)胞層、纖維囊、蛛網(wǎng)膜細(xì)胞層和中央核)。實(shí)驗(yàn)犬蛛網(wǎng)膜絨毛主要位于上矢狀竇中份偏前的部分，與中央靜脈回流至上矢狀竇的位

12、置基本吻合。 (2)電鏡研究的結(jié)果顯示犬蛛網(wǎng)膜絨毛內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)膜小泡在腦積水狀態(tài)下減少。 (3)犬蛛網(wǎng)膜絨毛表面完整地覆蓋了內(nèi)皮細(xì)胞。其CD31免疫熒光染色在腦積水時(shí)無變化。絨毛表面的內(nèi)皮細(xì)胞vonWillebrand因子表達(dá)較竇壁內(nèi)皮細(xì)胞減弱，但是在腦積水慢性期，絨毛內(nèi)皮細(xì)胞vonWillebrand因子表達(dá)發(fā)生了改變，提示了此時(shí)絨毛內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能可能發(fā)生了變化。 (4)在阻塞篩板，排除主要的頭頸淋巴引流