家蠅抗真菌肽MAF-1碳端第128位~153位衍生肽MAF-1A抗真菌機理的研究.pdf

1、目的:研究MAF-1碳端功能結(jié)構(gòu)域第128~153位26個氨基酸肽段(MAF-1A)的結(jié)構(gòu)特征、抗真菌活性特點、細(xì)胞毒性、抗菌機理以及對白色念珠菌致病性的影響,為發(fā)掘天然家蠅抗真菌肽MAF-1的藥物開發(fā)潛力,篩選高效、安全的新型抗真菌肽類模體或藥物,以及進一步研究家蠅的先天免疫機制提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
　　方法:1.采用生物學(xué)信息技術(shù)分析MAF-1A的結(jié)構(gòu)特征,FMOC固相合成,微量液體-菌落記數(shù)法檢測該肽體外抗真菌活性。2.

2、采用液體微量稀釋法、MTT法和平板菌落計數(shù)法檢測MAF-1A對常見致病性酵母菌抗菌活性及最小抑菌濃度和最小殺真菌濃度,繪制時間-殺菌曲線,并觀察金屬離子、FITC熒光標(biāo)記、胎牛血清和胰蛋白酶對其抗真菌活性的影響;采用分光光度法和MTT法檢測MAF-1A對人血細(xì)胞溶血性、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)的毒性作用以及宮頸癌Hela細(xì)胞體外增殖的抑制作用。3.采用FITC熒光標(biāo)記、激光掃描共聚焦顯微鏡、電鏡、流式細(xì)胞儀等技術(shù)觀察MAF-1

3、A對白色念珠菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響及其在細(xì)胞中的分子定位;采用DNA/RNA-肽結(jié)合凝膠阻滯實驗、DNaseⅠ足跡試驗法、光譜分析等方法研究MAF-1A對DNA/RNA結(jié)構(gòu)及其功能的影響。4.測定MAF-1A在MIC濃度下白色念珠菌的孢子萌發(fā)率及芽管形成率,采用瑞氏染色顯微鏡計數(shù),觀察在不同濃度MAF-1A預(yù)處理后及干預(yù)下,酵母相和菌絲相白色念珠菌定植人口腔黏膜上皮細(xì)胞(BEC)能力變化。5.采用氨基酸殘基替換法對MAF-1A進行結(jié)構(gòu)改造,

4、生物學(xué)信息技術(shù)分析其結(jié)構(gòu)特征,FMOC固相合成,并檢測改造多肽的體外抗真菌活性及人紅細(xì)胞溶血性。
　　結(jié)果:1.MAF-1A為一α螺旋線性肽,分子量3022.5Da,pI值9.23呈堿性,攜帶2個正電荷,保留MAF-1基本特征,N端富含賴氨酸(Lys),堿性氨基酸占總氨酸的26.9％;平均疏水指數(shù)-1.081;不具備跨膜結(jié)構(gòu),具有一個蛋白激酶C磷酸化結(jié)合位點和一個蛋白質(zhì)結(jié)合位點,具有白色念珠菌抗菌活性。2.MAF-1A對白色念珠菌

5、敏感株及耐藥菌均顯示出抗菌活性,0.1mg/ml濃度MAF-1A和氟康唑抗白色念珠菌效果相似;對常見致病性酵母菌MIC為0.1~0.8mg/ml、MFC為0.2~0.9mg/ml。殺菌曲線顯示MAF-1A作用真菌2h至14h逐漸發(fā)揮抗菌作用,呈現(xiàn)先殺菌后抑菌效應(yīng)。在含有NaCL或MgCL2環(huán)境中以及N端標(biāo)記FITC后,MAF-1A的殺菌效果減弱;與胎牛血清及胰蛋白酶作用后喪失抗真菌活性。MAF-1A無溶血活性;對人hBMSCs細(xì)胞無毒性

6、作用;對Hela細(xì)胞表現(xiàn)出增殖抑制作用,隨著MAF-1A濃度增加抑制作用增強。3.采用熒光標(biāo)記技術(shù)證實MAF-1A約3h后吸附白色念珠菌細(xì)胞表面,進入細(xì)胞后逐步在細(xì)胞內(nèi)聚集。MAF-1A作用12h和24h培養(yǎng)物掃描電鏡顯示,菌體細(xì)胞表面粗糙、凹凸不平、穿孔、菌體破裂胞質(zhì)流失、細(xì)胞皺縮,隨著時間延長病變加重;透射電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜多處不連續(xù)環(huán)形缺口,部分細(xì)胞可見胞核碎裂,細(xì)胞器模糊不清,胞漿原生質(zhì)紊亂,并出現(xiàn)多個斑片狀低電子密度區(qū)。MAF-1

7、A作用細(xì)胞后細(xì)胞表面疏水性降低,流式細(xì)胞技術(shù)進一步證實MAF-1A破壞細(xì)胞膜影響其完整性。MAF-1進入細(xì)胞可與DNA或RNA結(jié)合,結(jié)合核苷酸序列無特異性,且與RNA的結(jié)合能力強于DNA;光譜分析結(jié)果證實,MAF-1A可能通過靜電結(jié)合或溝槽作用與DNA或RNA結(jié)合,隨著肽-DNA復(fù)合物的形成逐漸破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)使得DNA結(jié)構(gòu)變得松散、斷裂;RT-PCR結(jié)果顯示MAF-1A作用真菌細(xì)胞后膜結(jié)構(gòu)基因或耐藥基因表達均不同程度的上調(diào),作用

8、12h時的上調(diào)水平高于24h。4.MAF-1A作用白色念珠菌后,芽生孢子萌發(fā)率及芽管形成率小于藥物陽性對照和陰性對照組(P<0.05);MAF-1A可減少白色念珠菌酵母相細(xì)胞或菌絲相細(xì)胞對人BEC細(xì)胞的粘附數(shù),且減少酵母相細(xì)胞粘附作用強于菌絲相細(xì)胞(P<0.05)。5.采用氨基酸替換法改造后的多肽MAF-1B抗真菌譜同MAF-1A,抗菌活性提高,但溶血性有所增加,提示可以MAF-1A為模體,對天然抗真菌肽MAF-1功能結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵氨基酸結(jié)

9、構(gòu)進行進一步研究。
　　結(jié)論:1.MAF-1A具有抗真菌活性,為一新的抗真菌α-螺旋線性多肽,分子量3022.5Da,pI值9.23呈堿性,不具備跨膜結(jié)構(gòu),含有一個蛋白激酶C磷酸化結(jié)合位點和一個蛋白質(zhì)結(jié)合位點,結(jié)構(gòu)不同于已發(fā)現(xiàn)的昆蟲抗菌肽;MAF-1A為MAF-1的結(jié)構(gòu)功能域中一個重要組成結(jié)構(gòu)。2.MAF-1A對包括耐藥菌株在內(nèi)的多種念珠菌和新生隱球菌具有抗菌活性,并呈現(xiàn)先殺菌后抑菌、抗菌有一定選擇性的特點;對人hBMSCs細(xì)胞無