家蠅抗真菌肽MAF-1原核表達(dá)體系優(yōu)化與活性分析.pdf

1、目的:優(yōu)化重組pET-28a(+)-MAF-1（Musca domestica antifungal peptide-1）原核表達(dá)體系。
　　方法:
　　1、比較E.coli BL21/(DE3)、E.coli OrigamiB/(DE3)兩株宿主菌、不同的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間和異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)濃度對重組MAF-1原核表達(dá)結(jié)果的影響，融合蛋白用鎳離子金屬螯合劑親和層析柱進(jìn)行蛋白純化，采用SDS-PAG

2、E電泳和Quantity One凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對表達(dá)結(jié)果檢測分析，以確定最佳的表達(dá)條件。
　　2、以白色念珠菌 Candida albicans ATCC10231為指示菌，采用微量液體-菌落記數(shù)法檢測重組MAF-1體外抗真菌活性，觀察胰蛋白酶、熱和凍融處理對表達(dá)產(chǎn)物抗真菌活性的影響；并檢測重組MAF-1體外凝集活性、及溶血活性，以及重組MAF-1去除His后對抗真菌活性的影響。
　　3、以家蠅重組MAF-1原核表達(dá)體

3、系為基礎(chǔ)，與課題組前期通過克隆獲取的家蠅溶菌酶基因(LZM)構(gòu)建成融合基因，采用同步酶切連接技術(shù)構(gòu)建pET-28a(+)-MAF-1-LZM/E.coli OrigamiB/(DE3)原核表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)，并檢測其活性。
　　結(jié)果:
　　1、pET-28a(+)-MAF-1重組質(zhì)粒選擇E.coli OrigamiB/(DE3)作為宿主菌，在34℃、IPTG終濃度0.025mmol/L、誘導(dǎo)18小時的優(yōu)化條件下獲得重組MAF-

4、1最大表達(dá)量，上清和純化后的目的蛋白SDS-PAGE檢測條帶灰度值分別為：808±4、412±2，測得其蛋白濃度為0.706 mg/ml，而以E.coli BL21/(DE3)作為宿主菌，在37℃、IPTG終濃度1.0mmol/L、誘導(dǎo)6小時優(yōu)化條件下可獲得重組MAF-1的最大表達(dá)量，上清和純化后的目的蛋白SDS-PAGE檢測條帶的灰度值分別為：258±5、173±7，測其蛋白濃度為0.401mg/ml，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　

5、2、采用優(yōu)化OrigamiB/(DE3)體系表達(dá)重組MAF-1對白色念珠菌顯示出抑菌活性，其最低抑菌濃度70μg/ml，與E.coli BL21/(DE3)體系破包涵體復(fù)性后獲取的重組MAF-1作用白色念珠菌的最低抑菌濃度100μg/ml比較，其抗真菌活性有所提高；重組MAF-1無凝集紅細(xì)胞活性、無溶血活性，其在胰蛋白酶作用下喪失抗真菌活性，經(jīng)95℃加熱處理至120，及經(jīng)-80℃度反復(fù)凍融處理，重組MAF-1抗真菌活性不被滅活，重組MA

6、F-1 His標(biāo)簽是否去除對其抗菌活性無顯著影響。
　　3、成功構(gòu)建pET-28a(+)-MAF-1-LZM原核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至E.coli OrigamiB/(DE3)中獲得成功表達(dá)，其純化后的重組MAF-1-LZM具有體外抗真菌活性，其最低抑菌濃度為100μg/ml。
　　結(jié)論:
　　1、篩選E.coli OrigamiB/(DE3)為pET-28a(+)-MAF-1重組質(zhì)粒的較適宜表達(dá)宿主菌，在34℃、IPTG

7、終濃度0.025mmol/L、誘導(dǎo)18小時，可獲得高效可溶性表達(dá)。
　　2、OrigamiB/(DE3)表達(dá)體系重組MAF-1體外抗真菌活性較E.coli BL21/(DE3)體系有提高；無凝集活性，無溶血活性；其在胰蛋白酶作用喪失抗真菌活性；其具有耐熱、耐凍融特性；His標(biāo)簽對其抗菌活性無顯著影響。
　　3、重組融合MAF-1-LZM在E.coli OrigamiB/(DE3)中成功表達(dá)，抗真菌實驗顯示其具有體外抗真菌活性