抗菌肽MAT28和RL4的抗真菌活性及機制研究.pdf

1、抗菌肽是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。它們是一類對細菌、真菌、病毒以及腫瘤細胞表現(xiàn)出良好的抑制作用的小分子多肽，是新型抗生素開發(fā)的良好候選資源。
　　 本課題采用NCCLS推薦的M27-A2方案，以臨床對氟康唑耐藥的白念珠菌作受試菌株，通過微量液基稀釋法對31條動物抗菌肽進行體外抗耐藥真菌活性測定，結果顯示其中僅抗菌肽RL4和MAP28對受試耐藥菌株都表現(xiàn)出明顯且穩(wěn)定的抑菌活性(MIC80分別為12.2μM，9.4μM)，其

2、余抗菌肽活性較弱（MIC80值范圍為20.2～57.1μM）或是未表現(xiàn)出抑菌活性。當通過棋盤式微量液基稀釋法，將31條抗菌肽與氟康唑聯(lián)合進行抗耐藥白念珠菌活性測定時，發(fā)現(xiàn)僅RL7、LR5、LR7與氟康唑合用對一株耐藥白念珠菌顯示出一定的協(xié)同作用(FICI＜0.5)，其余抗菌肽與氟康唑合用表現(xiàn)為相加或無關。基于抗菌肽RL4和MAP28對氟康唑耐藥菌具有良好的抗菌活性，本課題全面考察了RL4和MAP28對真菌的抗菌作用并對其作用機制進行了初

3、步探討，為抗真菌耐藥研究提供新思路。
　　 首先，微量液基稀釋法測定結果表明抗菌肽RL4和MAP28對多種真菌均具有良好的抗真菌活性，MIC80值的范圍分別為6.1～48.8μM和2.32～18.8μM，尤其對一些唑類耐藥菌，RL4和MAP28的抗菌活性都比氟康唑高。瓊脂平板紙片擴散實驗證實了RL4和MAP28的抗菌活性。最低殺菌濃度的測定和時間殺菌曲線實驗發(fā)現(xiàn)一定濃度下RL4和MAP28都表現(xiàn)出殺菌作用。多肽作用后胞內PI(P

4、ropidium Iodide)熒光強度的測定證實了RL4和MAP28在短時間內可發(fā)揮抗真菌的作用。同時菌絲生長實驗證實RL4和MAP28對耐藥菌菌絲的形成具有抑制作用。
　　 本課題進一步通過對氟康唑耐藥白念珠菌細胞膜通透性改變和氧化損傷作用等方面的分析，考察了RL4和MAP28抗白念珠菌的作用機制。研究結果表明:RL4對胞內鉀離子的外排沒有顯著性影響，但會引起耐藥菌胞內生物大分子的外泄，并能快速改變細胞膜的通透性，促進PI進

5、入胞內，發(fā)揮抗真菌作用。電鏡觀察結果可見，RL4作用后細胞膜皺縮，部分真菌的細胞壁和細胞膜形成明顯的裂口。而MAP28可迅速促進胞內鉀離子外排，同時可快速引起胞內生物大分子的外泄，引起膜通透性改變，發(fā)揮抗菌作用;電鏡觀察結果可見細胞膜破壞嚴重，且胞內FITC標記MAP28的綠色熒光可時間依賴性增強。此外MAP28能夠劑量依賴性的升高白念珠菌內源性活性氧水平，降低線粒體膜電位;且低濃度MAP28能夠促進真菌細胞凋亡，高濃度MAP28直接殺