卵巢癌乳腺癌耐藥細胞分泌型細胞因子表達的實驗研究.pdf

1、第一章蛋白質(zhì)芯片檢測卵巢癌耐藥細胞分泌型細胞因子表達差異 1資料與方法 1.1：研究對象： (1)卵巢癌細胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8，均來源于美國標準菌庫(ATCC)； (2)卵巢癌細胞株A2780來源的1A9克隆及其相應(yīng)的耐TAXOL細胞株P(guān)TX22(Emory大學(xué)腫瘤研究中心Dr.GiannakakouP贈送)； 1.2：實驗方法：

2、 (1)采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測卵巢癌細胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8的對常見化療藥物卡鉑(CBPDA)，阿霉素(ADM)，泰素(TAXOL)和VP-16敏感性差異； (2)使用細胞因子抗體蛋白質(zhì)芯片檢測試劑盒HV(人類細胞因子系列5)同步檢測卵巢癌細胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8條件培養(yǎng)液79種分泌型細胞因子表達

3、差異； (3)使用細胞因子抗體蛋白質(zhì)芯片檢測試劑盒2000(人類細胞因子系列6+7+8)同步檢測卵巢癌細胞株1A9及其相應(yīng)的耐TAXOL細胞株P(guān)TX22的174種分泌型細胞因子表達差異。 1.3：統(tǒng)計學(xué)方法：蛋白質(zhì)芯片采用RayBiotechINC蛋白質(zhì)芯片分析工具軟件密度值，藥敏試驗采用Sigmaplot軟件作出濃度生存曲線及回歸方程。數(shù)據(jù)用SPSS11.5FORWINDOWS軟件處理，以P＜0.05為顯著性差異標準。

4、 2結(jié)果 1.藥敏試驗結(jié)果表明卵巢癌細胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3，OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8耐藥性不同。 2.細胞因子抗體蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果表明在卵巢癌細胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8中生長調(diào)節(jié)致癌基因(GRO)，生長調(diào)節(jié)致癌基因-α(GRO-α)，白介素-6(IL-6)，白介素-8(IL-8)，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-2(TIM

5、P-2)，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)6種因子在不同細胞株表達有顯著差異： 3.卵巢癌細胞株SKOV3中GRO，IL-6，IL-8和TIMP-2均較4株與之相比相對敏感細胞(IGROV1，OVCAR3，OVCAR5，OVCAR8)增高，OVCAR4細胞中IL-6，IL-8較之IGROV1，OVCAR3，OVCAR5均升高。 4.細胞因子抗體蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果表明在卵巢癌細胞株1A9及其相應(yīng)的耐TAXOL細胞株P(guān)TX

6、22中，神經(jīng)生長因子受體(NGFR)，白細胞介素-8(IL-8)，IP-10，OncostatinM，正常T細胞表達的激活調(diào)節(jié)因子(RANTES)共5種因子在耐藥細胞株中表達增高，而同時共有15種因子在在耐藥細胞株中表達降低。其中炎癥反應(yīng)及趨化因子8種，細胞增殖的絲裂原及其抑制劑6種。 第二章白介素-6/8對乳腺癌細胞多藥耐藥作用機制的研究--乳腺癌耐藥相關(guān)分泌型細胞因子篩查 1資料與方法 1.1：研究對象：

7、 (1)人乳腺癌細胞MCF-7/S，及相應(yīng)的耐阿霉素細胞株MCF-7/R(Emory大學(xué)婦產(chǎn)科研究室DrRuopanHuang提供)，MCF-7/R為采用逐步接觸濃度遞增的阿霉素誘導(dǎo)而成，經(jīng)MTT法測定細胞的藥敏性證實具有多藥耐藥性。(2)IL-6及IL-8SiRNA質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)染的MCF-7/R細胞株(Emory大學(xué)婦產(chǎn)科研究室DrRuopanHuang提供)，ELISA檢測培養(yǎng)液IL-6或IL-8濃度證實蛋白表達抑制率，選擇IL-

8、6或IL-8蛋白抑制率大于80％的細胞各兩株，(MCF-7/RpSiRNAIL-6，MCF-7/RpSiRNAIL-8)及空載體對照株各1株(MCF-7/RpRNAVector，MCF-7/SpRNAVector)。 1.2：實驗方法： (1)使用細胞因子抗體蛋白質(zhì)芯片檢測試劑盒1000(人類細胞因子系列6+7)同步檢測MCF-7/S及MCF-7/R條件培養(yǎng)液120種分泌型細胞因子表達差異； (2)采用酶聯(lián)免疫分

9、析(Enzyme-linkedimmunoadsordassay,ELISA)測定選擇IL-6，IL-8，MCP-1MCF-7/S及MCF-7/R條件培養(yǎng)液濃度差異； (3)采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測在MCF-7/S及MCF-7/R細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的IL-6抗體，IL-8抗體及二者的混合液后，其對阿霉素(ADM)，泰素(TAXOL)的藥物敏感性變化； (4)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscr

10、iptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測MCF-7/S及MCF-7/R細胞株I1-6，I1-8，IL-6受體α，IL-8受體CXCR1，IL-8受體CXCR2表達差異； (5)westernblot檢測MCF-7/S及MCF-7/R細胞株p糖蛋白(p-GP)，肺耐藥蛋白(LRP)，多藥耐藥蛋白(MRP)及bcl-2蛋白表達差異；檢測MCF-7/S細胞用0.1M的ADM處理，加藥后0，24h，

11、48h，72h，96h，120h，144細胞及MCF-7/RpSiRNAIL-6，MCF-7/RpSiRNAIL-8細胞LRP表達差異；檢測MCF-7/RpSiRNAIL-6，MCF-7/RpSiRNAIL-8細胞bcl-2蛋白表達差異(6)免疫沉淀法westernblot檢測bcl-2MCF-7/S及MCF-7/R細胞株色氨酸磷酸化差異，采用bcl-2抗體沉淀，然后分別以bcl-2及磷酸化色氨酸抗體為一抗進行westernblot檢測

12、。 2結(jié)果 1.細胞因子抗體蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果表明在人乳腺癌細胞MCF-7/S，及相應(yīng)的耐阿霉素細胞株MCF-7/R中的表達結(jié)果表明分泌型細胞因子中，有15種細胞因子在耐藥株表達增高，5種細胞因子在耐藥株表達降低，其中炎癥反應(yīng)及趨化因子7種，細胞增殖的絲裂原及其抑制劑6種。 2.ELISA測定結(jié)果表明在乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/R的IL-6，IL-8及MCP-1分泌較敏感株MCF-7/S顯著升高，敏感株MCF-

13、7/S經(jīng)阿霉素作用后IL-6，IL-8及MCP-1濃度隨作用時間延長而增加。 3.藥敏試驗結(jié)果表明使用中性抗體阻斷IL-6和/及IL-8均可使耐藥細胞株MCF-7/R藥物敏感性較使用IgG對照組增加，其中以雙抗體組增加最明顯。SiRNA抑制耐藥細胞株MCF-7/R內(nèi)源性IL-6或IL-8表達可使其耐藥性較空載體對照組明顯降低，接近敏感細胞株水平。 4.RT-PCR檢測結(jié)果表明在乳腺癌細胞株MCF-7中，敏感株與耐藥株均有

14、IL-6和IL-8受體表達，其中在敏感細胞株中IL-6受體α，IL-8受體CXCR2，均較耐藥株升高，而IL-8受體CXCR1在敏感細胞株中均較耐藥株降低。 5.westernblot檢測證實(1)在阿霉素誘導(dǎo)的耐藥細胞株MCF7/R中，耐藥相關(guān)蛋白表達狀況為，多藥耐藥蛋白(MRP)表達與敏感株無顯著差異，p糖蛋白(p-GP)及肺耐藥蛋白(LRP)在耐藥株表達升高。(2)在敏感株MCF-7/S經(jīng)阿霉素作用后LRP表達隨作用時間延

15、長而增加。(3)IL-6siRNA和IL-8siRNA轉(zhuǎn)染陽性細胞株LRP表達為陽性，與耐藥細胞株MCF7/R類似。(4)MCF7/Rbcl-2表達較MCF7/S降低，且在IL-6siRNA和IL-8siRNA轉(zhuǎn)染陽性細胞株中表達亦降低。(5)采用免疫沉淀法westernblot進一步檢測證實MCF7/R的bcl-2色氨酸磷酸化增強。 6.氚標記胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)摻入合成法證實經(jīng)阿霉素處理后1-4天，MCF7/R細

16、胞在各時間點均較MCF7/S增殖速率增加。 結(jié)論 1.通過對卵巢癌泰素耐藥細胞株及乳腺癌多藥耐藥細胞株細胞因子篩選，發(fā)現(xiàn)多種細胞因子表達差異，在兩組細胞均以炎癥反應(yīng)趨化因子和細胞增殖絲裂原及其抑制劑為主。推測卵巢癌乳腺癌細胞耐藥的分泌型細胞因子調(diào)節(jié)可能主要通過這兩條途徑進行。 2.在常見分泌型細胞因子中，GRO，IL-6，IL-8和TIMP-2升高可能與卵巢癌一線化療藥ADM和CBPDA耐藥性相關(guān)，IL-6，IL

17、-8可能與卵巢癌二線化療藥TAXOL，VP16耐藥性相關(guān)。 3.外源性IL-6和/或IL-8阻斷均可增加耐藥細胞株MCF-7/R的藥物敏感性，若同時阻斷兩者作用呈現(xiàn)疊加效應(yīng)，提示IL-6及IL-8均在乳腺癌耐藥發(fā)生過程中具有重要作用。 4.盡管化療藥作用于MCF-7細胞引起時間依賴性IL-6及IL-8濃度增加的同時，也可引起肺耐藥蛋白(LRP)時間依賴性表達增加，但是IL-6siRNA和IL-8siRNA阻斷IL-6及I