沙丁胺醇對(duì)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞致敏狀態(tài)下Eotaxin表達(dá)的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的:通過觀察體外大鼠氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)在致敏狀態(tài)下對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)的表達(dá)及沙丁胺醇對(duì)其表達(dá)的影響,探討氣道平滑肌細(xì)胞對(duì)哮喘氣道炎癥的影響及可能的作用機(jī)制。
　　 方法:6只清潔級(jí)雌性SD大鼠于第1、8d給予OVA混懸液[含OVA25μg(V級(jí))+Al(OH)31mg]1mL腹腔注射致敏,第15～19d將大鼠置于密閉25cm×15cm×15cm自制霧化箱中,霧化吸入2％OVA,每天1次,每次30m

2、in。末次霧化激發(fā)4h后麻醉大鼠、采集血液,離心后收集血清備用。
　　 貼壁法體外培養(yǎng)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞,培養(yǎng)的大鼠ASMC經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫組化方法鑒定,實(shí)驗(yàn)選用第4～6代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為6組:A組(致敏對(duì)照組),細(xì)胞中加入致敏血清:B組(沙丁胺醇組),細(xì)胞中同時(shí)加入致敏血清及沙丁胺醇;C組(地塞米松組),細(xì)胞中同時(shí)加入致敏血清及地塞米松;D組(聯(lián)合治療組),細(xì)胞中同時(shí)加入致敏血清及沙丁胺醇和地塞米松;E組(致敏血清組),僅在生理鹽

3、水中加入致敏血清；F組(正常對(duì)照組),細(xì)胞中加入胎牛血清。各組所加入致敏血清來自于之前收集的哮喘動(dòng)物模型,加入比例為10％;加入沙丁胺醇終濃度為10μM,加入地塞米松終濃度為1μM。
　　 各組細(xì)胞樣本培養(yǎng)6h后收集培養(yǎng)液,離心后吸取上清分裝于EP管中,按照試劑盒說明,以酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定上清中Eotaxin水平;用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)定各組大鼠培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)Eotaxin mRNA的表達(dá)強(qiáng)度;放射免疫法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)

4、cAMP含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的鑒定:細(xì)胞呈條形或梭形,胞質(zhì)豐富核仁清晰,細(xì)胞間平行排列,密度適中。α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色:高倍視野鏡下,可見胞漿內(nèi)α-actin綠色熒光,呈絲狀平行均勻分布。
　　 2.細(xì)胞內(nèi)Eotaxin mRNA水平表達(dá)相對(duì)光密謀值及cAMP含量測(cè)定:A組分別為(1.3909±0.0411)ng/L、(17.5825±3.6233)ng/L;B組分別為(0

5、.7473±0.0764)ng/L、(76.6835±1.1825)ng/L:C組分別為(O.7727±0.1895)ng/L、(58.9892±5.9366)ng/L;D組分別為(0.5697±0.0954)ng/L、(94.0743±4.6388)ng/L,E組分別為(O.1859±0.0391)ng/L、(9.6140±0.6108)ng/L;F組分別為(0.0490±0.0094)ng/L、(32.3937±3.3600)ng/

6、L。與正常對(duì)照組比較,各組中Eotaxin mRNA水平均升高(P＜0.05);哮喘對(duì)照組中Eotaxin mRNA的條帶相對(duì)光密度高于其余各組。沙丁胺醇組、地塞米松組、聯(lián)合治療組這3組中,Eotaxin mRNA含量高于正常對(duì)照組及致敏血清組(P＜O.05)且低于哮喘對(duì)照組(P＜O.05),而上述3組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與正常對(duì)照組比較,各組cAMP含量均有變化(P＜0.05),其中哮喘對(duì)照組及致敏血清組中含量低于對(duì)照組而沙丁胺醇、

7、地塞米松組及聯(lián)合治療組中cAMP水平高于正常對(duì)照組(P＜O.05)。
　　 3.細(xì)胞培養(yǎng)液中Eotaxin含量檢測(cè),A組為(107.0866±7.1190)ng/L;B組為(67.8977±5.3137)ng/L;C組為(64.1869±4.0497)ng/L;D組為(53.8415±4.7473)ng/L;E組為(17.0061±3.8343)ng/L;F組為(O.6325±0.5622)ng/L。與正常組比較,各組中Eota

8、xin含量均升高(P＜0.05),其中哮喘對(duì)照組中Eotaxin含量最高,與其余各組比較有差異(P＜0.05);沙丁胺醇組、地塞米松組及聯(lián)合治療組中Eotaxin水平次之并依次降低,各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。致敏血清組中亦有Eotaxin低水平表達(dá),與各組比較有差異(P＜0.05)。A、B、C、D四組上清EOT含量與胞內(nèi)cAMP表達(dá)經(jīng)Pearson分析呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01),相關(guān)系數(shù)r=-0.788。
　　 結(jié)論:經(jīng)哮喘大鼠血清