四君子湯防治D—半乳糖所致小鼠腦細胞線粒體損傷機理研究.pdf

1、1選題思路和研究目的隨著人口老齡化的日益明顯，如何延緩衰老，提高年老者的生活質量，已成為醫(yī)學界研究的重大課題。近年來，中醫(yī)藥以“腎為先天之本”理論為指導，開展了大量研究工作，闡明了一些中醫(yī)藥抗衰老的機理。然而，衰老是一個多因素綜合作用的復雜過程，其中脾作為“后天之本”對衰老過程的影響亦不容忽視。 中醫(yī)學對衰老的認識，早在《黃帝內經(jīng)》時代就已有概說?！饵S帝內經(jīng)》對于人進入一定年齡階段將必然衰老的原因和衰老發(fā)生機制，有較為全面的論述

2、?！秲冉?jīng)》提出：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長。……五七，陽明脈衰，面始焦，發(fā)始墜?！煞虬藲q，腎氣實，發(fā)長齒更?！税?，則齒發(fā)去。腎主水，受五臟六腑之精而藏之，故五臟盛乃能瀉。今五臟皆衰，筋骨懈墜，天癸盡矣，故發(fā)鬢白，身體重，形步不正，而無子耳。”(《素問·上古天真論》)“人生十歲，五臟始定血氣已通，其氣在下，故好走?！呤畾q，脾氣虛，皮膚枯；……百歲，五藏皆虛，神氣皆去，形骸獨居而終矣”。(《靈樞·天年》)等觀點，明確認為，衰老

3、將隨增齡而必然發(fā)生，隨增齡而自發(fā)的臟腑氣血的生理病理變化為衰老的內在原因。 脾胃虛損與衰老相關的學說源于《內經(jīng)》，唐、宋、元、明、清諸醫(yī)家，均對其有所發(fā)展。著名的補土學家李東垣將其重視脾胃的學術思想亦貫入到抗老延年的觀點中，曰：“凡有此(脾胃)病者，雖不易變生他疾，已損天年”，并主張“調理脾胃，老年當先”(《脾胃論》)。李中梓則提出了“先天之本在腎，后天之本在脾”的觀點。張介賓曰：脾腎“皆為五臟六腑之本”，“土為萬物之源，胃氣為

4、養(yǎng)生之本……是以養(yǎng)生家必以脾胃為先……善養(yǎng)脾胃之道，所以便能致壽”(《景岳全書》)。吳昆曰：“諸臟腑百骸皆受氣于脾胃，而后能強，若脾胃一虧，則眾體皆無以受氣，日見蔽弱矣.”(《醫(yī)方考》)。龔廷賢曰：“凡年老之人，當以養(yǎng)元氣，健脾胃為主”(《衰老論)。王文祿曰：“是以養(yǎng)脾者……養(yǎng)生之要也?！?《醫(yī)先》)等等。總之，脾胃受到了普遍性的高度重視，并把這一重視脾胃的思想極大地貫入到抗老延年的理論指導和治法方藥之中，并以之與補腎抗衰老相提并論，視

5、之為抗衰老的兩大最重要原則。 現(xiàn)代研究表明，健脾法可通過不同環(huán)節(jié)對抗機體的衰老，其延緩衰老作用值得進一步探討。本課題以健脾益氣代表方四君子湯為研究手段，觀察其對衰老小鼠模型mtDNA缺失的影響，以期從基因水平探討脾與衰老的關系，闡明健脾益氣法延緩衰老的分子作用機制。研究結果將豐富中醫(yī)“脾胃學說”理論的內涵，為延緩衰老提供新的思路和理論依據(jù)，并為開發(fā)研制抗衰老新藥奠定理論基礎。 2研究方法21小鼠衰老模型的建立選用2月齡昆

6、明種小鼠隨機分為6組：正常對照組，模型對照組，維生素E(250mg·kg-1·d-1)組，四君子湯高(20g·kg-1·d-1)、中(10g·kg-1·d-1)、低劑量(5g·kg-1·d-1)組。D-半乳糖亞急性衰老模型，水迷宮測試確定學習記憶障礙模型成立。 22觀測指標221小鼠行為學觀測一般狀況觀察及小鼠學習和記憶能力測試，造模前后各進行一次。 222小鼠腦組織NO和NOS含量的測定硝酸還原酶法測定NO含量；根據(jù)標

7、準品吸光值，計算NOS活性。 223谷光甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性測定黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，DTNB顯色法測定GSH-Px。 224琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase，SDH)比活性測定按試劑盒說明操作。 225小鼠海馬組織線粒體DNA缺失的測定PCR擴增法。 226Fura-2/AM雙波長熒光法測定小鼠海馬鈣濃度熒光分光光度計測定。 227透射電鏡樣品制備

8、及觀察透射電鏡觀察線粒體形態(tài)結構改變并攝片。 228腦細胞凋亡的檢測方法流式細胞儀檢測法。 3實驗結果31一般情況觀察模型組小鼠大多數(shù)表現(xiàn)為毛發(fā)無光或脫落、精神萎靡、進食減少、行動遲緩、活動減少；部分小鼠可出現(xiàn)共濟失調、自發(fā)運動增多或自我嘶咬等癥狀。藥物治療組小鼠也可在造模1個月左右表現(xiàn)為與模型組類似的癥狀，但癥狀較輕，且這些癥狀在2月內逐漸減輕。空白對照組小鼠均未出現(xiàn)上述類似癥狀。 32四君子湯對D-半乳糖誘致

9、小鼠學習記憶障礙的改善作用D-半乳糖處理8周時，模型組小鼠學習和記憶能力明顯減弱，表現(xiàn)為學習和記憶階段的游完全程時間明顯延長，進入盲端的錯誤次數(shù)明顯增加，與正常對照組小鼠比較具有明顯差異(P＜0.01)，而四君子湯高劑量(SG)、中劑量(SZ)、低劑量(SD)及維生素E處理后，明顯縮短模型小鼠學習和記憶階段游完全程時間和減少進入盲端的錯誤次數(shù)(P＜0.01，P＜0.05)。 33四君子湯對D-半乳糖誘致學習記憶障礙小鼠腦組織NO

10、含量和NOS活性的影響D-半乳糖處理8周時，模型組小鼠腦組織中NO含量及NOS活性明顯高于正常對照組小鼠(P＜0.01)，而四君子湯高劑量(SG)、中劑量(SZ)、低劑量(SD)及維生素E處理后，模型小鼠腦組織中NO含量和NOS明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。 34四君子湯對D-半乳糖誘致學習記憶障礙小鼠腦內GSH-Px和SDH活性的影響D-半乳糖處理8周時，模型組小鼠腦組織中GSH-Px和SDH活力明顯低于正常對照組小

11、鼠(P＜0.01)，而SG、SZ、SD及維生素E處理后，模型小鼠腦組織中GSH-Px和SDH活力明顯升高(P＜0.01，(P＜0.05)。 35四君子湯對D-半乳糖誘致學習記憶障礙小鼠海馬神經(jīng)細胞內鈣離子濃度的影響與對照組比較，模型(M)組小鼠腦組織中Ca2+活力均顯著增加(P＜0.01)。與M組比較，給予高、中、低劑量的四君子湯和VitE灌胃6周后，SG、SZ、SD組小鼠腦組織中Ca2+活力均明顯降低(P＜0.01)。

12、 36四君子湯對小鼠腦海馬神經(jīng)細胞線粒體損傷時DNA突變的影響所有海馬標本均可見0.47kb片斷的一個條帶，其中模型組小鼠擴增出另一個約0.63kb片斷的條帶(FigA)。說明模型組小鼠海馬mtDNA中存在著約3.87kb片斷缺失。 37電鏡正常組海馬神經(jīng)細胞超微結構正常。 模型組海馬神經(jīng)細胞質疏松，胞漿電子密度增高，核仁仍清晰，大部分細胞器結構不清，脂褐素沉積增多，線粒體數(shù)目減少、線粒體腫脹，基質清淡、有空泡化，甚至見

13、大量線粒體嵴呈畸形樣變或缺失 給藥組海馬神經(jīng)細胞輪廓清晰，胞膜完整，雙層結構清晰，線粒體大量分布，形態(tài)規(guī)則，線粒體嵴清晰，胞質中除見核糖體增多外，均接近正常組 4結論不同劑量的四君子湯水提物均能有效干預腦的老化，不同程度的減輕腦海馬組織線粒體DNA的缺失，改善學習記憶能力。四君子湯干預腦老化的作用機制可能是：SJZ能提高抗氧化能力，調節(jié)機體氧化損傷與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調；降低鈣離子濃度，減少NOS的激活，阻止NO過量

14、生成，減輕自由基對神經(jīng)元的損傷，減少mtDNA缺失，改善線粒體能量代謝障礙，維護線粒體功能。由此推測，四君子湯可能通過多途徑、多環(huán)節(jié)，作用于多個靶點，而發(fā)揮其抗衰老的作用。 創(chuàng)新之處：本實驗所選tmRNA、GSH-Px等作為觀察指標，從行為學、形態(tài)學以及基因水平進行研究，技術層面新穎、完整，有一定的先進性。在理論方面，本研究從基因水平探求“脾虛衰老”理論的物質基礎，為補脾抗衰老提供實驗依據(jù)，進一步豐富了“脾虛衰老”理論的內涵。

15、 5總結通過對古今中醫(yī)衰老機理的理論及實驗研究文獻資料的綜合、分析，本實驗基于《內經(jīng)》和后世醫(yī)家對脾胃與衰老關系的認識，并結合現(xiàn)代人類生活方式的現(xiàn)狀，尤其是不健康飲食習慣影響脾胃功能、影響體內代謝，加速衰老的可能性，以健脾益氣代表方四君子湯為研究手段，以期從基因水平以及多個技術層面探討脾與衰老的關系，闡明健脾益氣法延緩衰老的分子作用機制。 從實驗結果來看，健脾益氣的手段確有干預腦的老化，減輕腦海馬組織線粒體DNA的缺失，改

16、善學習記憶的能力。也就是說，有一定程度的抗衰老作用。由此可以進一步說明脾胃和衰老的關系不容忽視。 結合目前的實驗結果，本課題下一步的研究可以從一下幾方面進行：①可對四君子湯進行拆方研究，以進一步確認延緩衰老的最佳配伍關系(有效單味藥或有效部位群)，為開發(fā)研制抗衰老新藥奠定基礎。此外，四君子湯改善衰老模型小鼠空間學習記憶能力的物質基礎有待于深入研究。由于影響衰老的因素眾多，本實驗僅從幾方面進行了觀察，相關進一步研究有待開展。②用脾