紫杉醇與四君子湯治療鼻咽癌動物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國南方及東南亞地區(qū)常見的惡性腫瘤之一,尤以廣東省珠江三角洲一帶多見,嚴(yán)重危害我國人民的健康。目前國內(nèi)外對NPC的發(fā)病因?yàn)?、易感性和癌變機(jī)理進(jìn)行了廣泛的研究,認(rèn)為NPC的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的過程,與EBV感染、化學(xué)促癌物和/或致癌物、及遺傳等因素有關(guān)。臨床上大部分鼻咽癌病例早期就出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,晚期NFC患者主要出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移,是

2、導(dǎo)致患者死亡的主要因?yàn)?。手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療是現(xiàn)階段治療NPC的主要治療手段,隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,對該病的檢測和治療都得到不斷改善,但NPC患者的五年生存率仍然不超過60％。
　　 紫杉醇為一種植物藥(paclitaxel,商品名Taxol),從紅豆杉的樹皮、樹根及枝葉中提取,催化微管蛋白迅速合成微管并結(jié)合到微管上起穩(wěn)定和防止微管解聚的作用,從而避免癌細(xì)胞的快速分裂,使其停止在G2期和M期直到死亡。紫杉醇也作用于巨噬細(xì)胞

3、上的腫瘤壞死因子(TNF)受體,促使釋放白細(xì)胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干擾素(IFN)-1、IFN-2對腫瘤細(xì)胞起殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞遷移作用。毒副作用主要表現(xiàn)為:骨髓抑制、惡心嘔吐、神經(jīng)毒性、關(guān)節(jié)肌肉疼痛、脫發(fā)。
　　 四君子湯組方源自于宋《太平惠民和劑局方》,是益氣健脾的經(jīng)典方劑,方中人參補(bǔ)益中氣,健脾和胃為君:白術(shù)溫脾燥濕為臣:佐以茯苓甘淡滲濕健脾,苓術(shù)合用,健脾除濕之功更強(qiáng):使以甘草養(yǎng)胃和中。全方共奏健脾和

4、胃,益氣養(yǎng)血之功效,具有治療榮衛(wèi)氣虛,臟腑怯弱的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,人參健脾益氣作用較強(qiáng),提高特異性和非特異性免疫功能最優(yōu):白術(shù)健脾益氣作用較強(qiáng),尤其能夠明顯升高血清總蛋白:茯苓有健脾益氣作用,但無增加脾虛模型動物體質(zhì)量的作用。
　　 綠色熒光蛋白基因是從生物發(fā)光的水母克隆出來的基因,它的cDNA編碼283個(gè)氨基酸殘基,不需要其它蛋白輔助、不需要底物、也不需要其它因子輔佐就能發(fā)出綠色熒光。人們采用GFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞來跟蹤

5、腫瘤形成及演進(jìn)的過程,極大地改善和提高了腫瘤特別是微小腫瘤在新鮮組織的可視化能力。GFP廣泛應(yīng)用于可視化的腫瘤動物模型,極大地推動了腫瘤的生長、發(fā)展規(guī)律的認(rèn)識和研究。
　　 在研究腫瘤的過程中,在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)復(fù)制出與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展十分相似的模型也是一個(gè)非常有用的方法。原位移植技術(shù)的開展,使許多更貼近臨床特征的腫瘤動物模型得以建立,包括自發(fā)骨轉(zhuǎn)移的原位移植的前列腺癌、乳腺癌和肺癌,自發(fā)肝臟和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌模型,以及胰腺癌、胃

6、癌、卵巢癌、膀胱癌和腎癌的模型。合適的人類腫瘤動物模型能驗(yàn)證人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的過程并能夠開展有效的實(shí)驗(yàn)干預(yù),從而彌補(bǔ)了人體腫瘤僅能通過活檢、手術(shù)標(biāo)本和尸檢等進(jìn)行分析的不足。但是這仍不能滿足人們從活體上觀察研究腫瘤演進(jìn)過程的要求。
　　 基因芯片(DNA芯片,DNA微陣列)技術(shù)、蛋白質(zhì)組技術(shù)及生物信息學(xué)(bioinformatics)的技術(shù)的迅速興起和應(yīng)用,為分子生物學(xué)和病理學(xué)的有機(jī)結(jié)合提供了絕好的機(jī)遇。面對數(shù)量龐

7、大的遺傳信息,建立新型雜交和測序方法以進(jìn)行高效、快速的檢測和分析顯得尤為重要。以基因芯片為代表的生物芯片技術(shù)的崛起為解決上述問題提供了光輝的前景。由于它具有體積小、包含信息豐富以及實(shí)驗(yàn)操作簡便的特點(diǎn),使得人們可以同時(shí)檢測同一組織或不同組織在不同生理和病理?xiàng)l件下成千上萬個(gè)基因的表達(dá)水平,闡明信號通路與基因表達(dá)之間的相互作用關(guān)系。
　　 研究目的:
　　 目前鼻咽癌的臨床治療效果仍差強(qiáng)人意,結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以有效手術(shù)切除、放射治療

8、與化學(xué)治療中難以避開的毒副作用,均制約著患者生存質(zhì)量的提高與鼻咽癌五年生存率進(jìn)展。所以,以中西醫(yī)結(jié)合的思路,將化療藥物與健脾補(bǔ)中益氣中藥聯(lián)合用于鼻咽癌治療,以期提高患者生存質(zhì)量及腫瘤治療效果,并進(jìn)行基因表達(dá)譜分析,尋找鼻咽癌治療候選基因就顯得尤為重要。
　　 方法:
　　 1、構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的鼻咽癌細(xì)胞系。
　　 2、建立可視裸鼠鼻咽癌模型。
　　 3、紫杉醇、四君子湯藥物干預(yù),尋求臨床治療鼻咽

9、癌化療過程中西藥與中藥結(jié)合的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 4、構(gòu)建DNA基因芯片,尋找陽性對照組與聯(lián)合用藥組的差異表達(dá)基因,從而縮小鼻咽癌治療的分子標(biāo)志范圍。
　　 結(jié)果:
　　 一、構(gòu)建鼻咽癌細(xì)胞系CNE-GFP及裸鼠模型。
　　 二、藥物干預(yù)后指標(biāo)檢測。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:紫杉醇單藥可有效殺傷腫瘤細(xì)胞,其毒副作用不可避免地使力竭后氧分壓下降、血BUN值升高；對外周血細(xì)胞、血紅蛋白、血清乳酸、免疫功能

10、、胃腸運(yùn)動均下降。四君子湯可增強(qiáng)機(jī)體的外周血細(xì)胞計(jì)數(shù),改善體液免疫功能。四君子湯與紫杉醇聯(lián)用,對各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著效果,RBC計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血清乳酸、最初60秒速度、脾細(xì)胞抗體、胃殘留率與正常對照組無差異。由此可以推測,紫杉醇與四君子湯聯(lián)合應(yīng)用治療中晚期鼻咽癌,可以發(fā)揮各自優(yōu)勢且協(xié)同作用,通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、提高機(jī)體免疫力等途徑對抗腫瘤細(xì)胞生長,并改善血紅蛋白含量、血清乳酸含量、機(jī)體攜氧運(yùn)氧能力、增加血細(xì)胞計(jì)數(shù)、對抗疲勞

11、,從而降低化療周期中的毒副作用,在臨床中可有效改善患者生存質(zhì)量。
　　 三、構(gòu)建基因表達(dá)譜,尋找與鼻咽癌治療有關(guān)基因。
　　 得到差異表達(dá)的基因共2620個(gè),其中差異表達(dá)在2倍以上的基因281個(gè)。對這281個(gè)基因進(jìn)行基因功能分析、信號通路分析、MILANO文獻(xiàn)分析,得到可能與鼻咽癌治療關(guān)系密切的基因24個(gè)。這24個(gè)基因與紫杉醇、四君子湯治療有關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1、建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白鼻咽癌細(xì)胞株

12、CNE-GFP,生長曲線、運(yùn)動能力實(shí)驗(yàn)、侵襲能力實(shí)驗(yàn)、同質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)、異質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)證明CNE-GFP細(xì)胞較其母系CNE細(xì)胞生物學(xué)特性并無改變。
　　 2、裸鼠皮下注射鼻咽癌細(xì)胞CNE-GFP懸液,約兩周左右可看到瘤塊形成。
　　 3、紫杉醇單藥可有效殺傷腫瘤細(xì)胞,其毒副作用不可避免地使力竭后氧分壓下降、血BUN值升高；使外周血細(xì)胞、血紅蛋白、血清乳酸、免疫功能、胃腸運(yùn)動下降。
　　 4.四君子湯可增強(qiáng)機(jī)體的外周血細(xì)

13、胞計(jì)數(shù),改善體液免疫功能。
　　 5.四君子湯與紫杉醇聯(lián)用,RBC計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血清乳酸、最初60秒速度、脾細(xì)胞抗體、胃殘留率與正常對照組無差異。由此可以推測,紫杉醇與四君子湯聯(lián)合應(yīng)用治療中晚期鼻咽癌,可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、提高機(jī)體免疫力等途徑對抗腫瘤細(xì)胞生長,并改善血紅蛋白含量、血清乳酸含量、機(jī)體攜氧運(yùn)氧能力、增加血細(xì)胞計(jì)數(shù)、對抗疲勞,從而降低化療周期中的毒副作用,可有效改善生存質(zhì)量。
　　 6.構(gòu)建鼻