DNA甲基化在鼻咽癌紫杉醇耐藥形成機(jī)制中的初步研究.pdf

1、第一章DNA甲基化芯片聯(lián)合表達(dá)譜芯片篩選鼻咽癌紫杉醇耐藥相關(guān)基因
　　 目的:探討DNA甲基化與鼻咽癌紫杉醇耐藥的相關(guān)性，采用DNA甲基化芯片聯(lián)合基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol與相應(yīng)親本細(xì)胞的甲基化譜和基因表達(dá)譜差異，并篩選出鼻咽癌紫杉醇耐藥相關(guān)基因。
　　 方法:使用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞整體甲基化水平，回歸性分析DN

2、A甲基化與鼻咽癌紫杉醇的耐藥相關(guān)性。采用NimbleGen HG18甲基化芯片和Affymetrix HG-U133 Plus2.0基因表達(dá)譜芯片分別分析鼻咽癌耐藥細(xì)胞的甲基化譜和基因表達(dá)譜系，并結(jié)合DNA甲基化芯片和基因表達(dá)譜芯片結(jié)果分析鼻咽癌紫杉醇耐藥相關(guān)基因。篩選出來的候選基因通過在線生物分析軟件進(jìn)行GO功能分類和KEGG信號(hào)通路分析，同時(shí)進(jìn)一步通過甲基化特異性PCR(MS-PCR)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR

3、）進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:鼻咽癌耐藥細(xì)胞CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol均呈整體高甲基化狀態(tài)，并隨腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥性的增強(qiáng)其甲基化水平增高。進(jìn)一步回歸性分析顯示DNA甲基化與紫杉醇耐藥性呈正相關(guān)。三個(gè)耐藥細(xì)胞系中DNA甲基化芯片篩選出117個(gè)甲基化共同差異基因，其中高甲基化基因83個(gè)(70.94％)，低甲基化基因34個(gè)(29.04％)。表達(dá)譜芯片篩選三個(gè)耐藥細(xì)胞系中共同表達(dá)差異的基因有32

4、7個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因129個(gè)(39.45％)，表達(dá)下調(diào)基因198個(gè)(60.55％)。結(jié)合兩種芯片結(jié)果篩選，獲得具有甲基化差異并且表達(dá)顯著改變的基因有48個(gè)。其中高甲基化、表達(dá)下調(diào)基因13個(gè)，低甲基化、表達(dá)上調(diào)基因14個(gè)。MS-PCR和Real-time PCR驗(yàn)證篩選的6個(gè)候選基因(CHFR、PEG10、ABCC5、 CDKN1C、 DLC1及ERBB2)，結(jié)果與甲基化芯片以及表達(dá)譜芯片一致。
　　 結(jié)論:DNA甲基化與鼻咽癌

5、紫杉醇耐藥形成密切相關(guān)，DNA異常甲基化后的耐藥相關(guān)基因表達(dá)改變導(dǎo)致腫瘤耐藥的形成。DNA甲基化芯片聯(lián)合基因表達(dá)譜芯片分析鼻咽癌紫杉醇耐藥的方法能夠有效、特異性地篩選耐藥相關(guān)基因，是研究腫瘤耐藥的一種非常好的手段。篩選出的候選基因通過功能分類和信號(hào)通路分析，被證明大部分參與了腫瘤耐藥形成機(jī)制。 CHFR、PEG10、ABCC、GSTP1、LC1及ERBB經(jīng)過驗(yàn)正可能成為特異的腫瘤耐藥標(biāo)志。
　　 第二章5-aza-dC逆轉(zhuǎn)鼻咽癌

6、紫杉醇耐藥性研究
　　 目的:觀察5-aza-dC對(duì)鼻咽癌親本細(xì)胞系（CNE-1、HNE-2和5-8F）和耐藥細(xì)胞系（CNE-1/Taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol）的生長(zhǎng)抑制作用，并比較其差異。初步研究5-aza-dC對(duì)鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞耐藥性的影響。
　　 方法:集落形成試驗(yàn)檢測(cè)5-aza-dC單藥及5-aza-dC聯(lián)合紫杉醇干預(yù)鼻咽癌親本和耐藥細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并觀察5-aza-dC逆

7、轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥性的作用。運(yùn)用Hochest染色法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)果:不同濃度梯度的5-aza-dC(0uM、1uM、2uM、5uM、10uM、15uM、20uM、25uM、30uM)對(duì)鼻咽癌親本和耐藥細(xì)胞增殖均有抑制作用，測(cè)得親本細(xì)胞CNE-1、HNE-2和5-8F的IC50值分別為:9.7±0.2uM、10.5±0.6uM、11.2±0.5uM;耐藥細(xì)胞系CNE-1/Taxol

8、、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol的IC50值分別為:4.9±0.3uM、5.3±0.2uM、6.1±0.3uM。結(jié)果顯示5-aza-dC對(duì)紫杉醇耐藥細(xì)胞系的抑制作用明顯高于親本細(xì)胞(p＜0.01)。5uM5-aza-dC預(yù)處理后紫杉醇對(duì)CNE-1/taxol、HNE-2/Taxol和5-8F/Taxol生長(zhǎng)抑制的IC50值分別為4.87±0.29nM、5.35±0.24、5.79±0.34，耐藥指數(shù)分別為3.43±0.11

9、、3.86±0.13、4.53±0.17其敏感性顯著增加(p＜0.01)，而親本細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性無明顯變化(P＞0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-aza-dC處理的鼻咽癌耐藥細(xì)胞，G0/G1期比例增加，凋亡比例增高，且顯著高于親本細(xì)胞系(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:5-aza-dC對(duì)鼻咽癌親本及紫杉醇耐藥細(xì)胞增殖均有抑制作用，紫杉醇耐藥細(xì)胞對(duì)具有更高的敏感性。5-aza-dC處理后耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物的敏感性明顯增加，從

10、而可以部分逆轉(zhuǎn)鼻咽癌對(duì)紫杉醇的化療耐藥。
　　 第三章5-aza-dC逆轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥機(jī)制研究
　　 目的:初步探討篩選出的候選基因CHFR、PE G10、ABCC5、 GSTP1、DLC1及ERBB2在鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)中的作用。
　　 方法:MS-PCR檢測(cè)5-aza-dC作用對(duì)候選基因甲基化狀態(tài)的影響。并通過Real-time PCR和western blot，在mRNA及蛋白質(zhì)水平對(duì)基因的表達(dá)

11、進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)觀察不同劑量5-aza-dC和紫杉醇處理對(duì)耐藥細(xì)胞基因的表達(dá)影響。
　　 結(jié)果:5-aza-dC對(duì)高甲基化基因CHFR、PEG10及DLC1具有去甲基化作用，但對(duì)低甲基化基因ABCC、GSTP1及ERBB2甲基化狀態(tài)無明顯影響。鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞表達(dá)下調(diào)基因CHFR、PEG10DL C1經(jīng)不同濃度5-aza-dC處理后mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)(p＜0.01)，而低甲基化基因ABCC5、 GSTP1及ERBB2