pEGFP-PTEN的構(gòu)建及其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B中的表達(dá).pdf

1、目的：
　　 采用基因同源重組技術(shù)，構(gòu)建攜帶外源性野生型PTEN基因的重組pEGFP質(zhì)粒，將外源性PTEN基因?qū)胱訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B中，觀察外源性野生型PTEN對(duì)HEC-1B細(xì)胞增殖的影響，為子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 應(yīng)用：RT-PCR方法從正常人胚腎細(xì)胞293T中獲得PTEN片段，應(yīng)用基因重組技術(shù)先克隆至pMD18-T載體，將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析及雙酶切后與pEGFP-N2載體

2、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N2-PTEN；利用脂質(zhì)體法將pEGFP-N2-PTEN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B中，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白在HEC-1B細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，Western blot法檢測(cè)PTEN蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染成功后通過(guò)MTT法檢測(cè)融合蛋白對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B增殖的影響。
　　 結(jié)果：
　　 pMD18-T-PTEN質(zhì)粒測(cè)序與GenBank中人PTEN編碼區(qū)(CDS)序列(NM-00

3、0314.4)一致；pEGFP-N2-PTEN重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到兩個(gè)大小分別為1.4kb和4.7kb的片段；外源性野生型PTEN基因在子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞中成功表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)出質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中PTEN蛋白質(zhì)高表達(dá)；過(guò)表達(dá)的野生型PTEN能有效抑制HEC-1B細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了pEGFP-N2-PTEN重組真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)脂