高血糖對(duì)脈絡(luò)膜新生血管的影響及其可能的機(jī)制.pdf

1、研究背景：脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是眼科多種致盲疾病的共同病理改變。其中年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是以 CNV為主要表現(xiàn)特征的疾病之一，晚期常表現(xiàn)為黃斑部CNV的形成，并伴有出血、滲出及瘢痕化等改變，嚴(yán)重影響視功能，是65歲以上老年人致盲的主要眼病之一。隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加快，AMD的發(fā)病率不斷攀升，但其發(fā)病機(jī)制仍未能闡明。AMD具有多因素致病的特點(diǎn)，研究AMD尤其是CNV發(fā)生的危險(xiǎn)因素，以識(shí)別易感人群并采取有效的疾病預(yù)防和治療

2、措施具有重要意義。
　　年齡、遺傳、心血管疾病及吸煙等已被證實(shí)是AMD發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，而作為心血管疾病確定的誘發(fā)因素，糖尿病與AMD尤其是CNV進(jìn)展相關(guān)性的研究已開(kāi)始引起學(xué)者關(guān)注。然而目前對(duì)上述疾病相關(guān)性的研究多為臨床流行病學(xué)調(diào)查，尚缺乏系統(tǒng)深入的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持，因此所得結(jié)果存在較多爭(zhēng)議。通過(guò)回顧文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)，高血糖導(dǎo)致氧化應(yīng)激是糖尿病及其血管并發(fā)癥的基本病理機(jī)制。而黃斑由于具有高耗氧、長(zhǎng)期光照以及多不飽和脂肪酸富集的特點(diǎn)，病理

3、條件下極易發(fā)生氧化損傷，氧化應(yīng)激也已證實(shí)是CNV發(fā)生的重要始動(dòng)因素之一。
　　基于糖尿病與 CNV相關(guān)性的研究現(xiàn)狀以及兩者共有的病理基礎(chǔ)，我們推測(cè)糖尿病可能對(duì)CNV相關(guān)疾病的發(fā)生具有一定影響，但其中牽涉怎樣的分子機(jī)制尚不清楚。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是整合多種細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，病理?xiàng)l件下 STAT3極易發(fā)生活化，并通過(guò)與血管內(nèi)皮因子(VEGF)的啟動(dòng)子相互作用，直接調(diào)控 VEGF的表達(dá)，在包括糖尿病及其并發(fā)

4、癥和CNV等病理性新生血管的形成中均發(fā)揮重要作用。
　　探索 CNV相關(guān)疾病發(fā)生的可能危險(xiǎn)因素，深入研究其中涉及的分子信號(hào)機(jī)制，尋找作用關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)將有助于我們更好的理解 CNV的發(fā)病機(jī)理，為預(yù)防并控制CNV相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供新思路。
　　目的：(1)建立鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病模型對(duì)激光致小鼠CNV嚴(yán)重程度的影響，檢測(cè)CNV生成早期氧化應(yīng)激水平、磷酸化STAT3(p-STAT3)以及 VEGF的表達(dá)變化；(2

5、)觀(guān)察抗氧化劑 N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠CNV的治療作用；(3)研究高糖培養(yǎng)條件下RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化和交互作用關(guān)系，探索高糖影響RPE細(xì)胞分泌促血管生成因子的可能分子機(jī)制。
　　方法：(1)腹腔注射STZ誘導(dǎo)建立C57BL/6J小鼠糖尿病模型，建模成功2 w后，532 nm激光光凝誘導(dǎo)建立小鼠CNV模型，之后予腹腔注射N(xiāo)AC治療，于光凝后14 d以眼底熒光素血管造影(FF

6、A)，脈絡(luò)膜鋪片和HE染色法分別檢測(cè)各組CNV的嚴(yán)重程度；(2)激光共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察各組光凝后3 d CNV局部DNA氧化損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)，p-STAT3和VEGF的表達(dá)，ELISA檢測(cè)小鼠眼部VEGF水平的變化；(3)在高糖和/或高滲透壓條件下體外傳代培養(yǎng)人 RPE細(xì)胞，并分別用NAC和JAK2激酶抑制劑AG490對(duì)RPE細(xì)胞進(jìn)行處理，以western blot檢測(cè)p-STAT3蛋白的表達(dá)，RT-PCR和

7、ELISA分別檢測(cè)RPE細(xì)胞內(nèi)VEGFmRNA的表達(dá)和培養(yǎng)上清液中VEGF的含量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組RPE細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平變化。
　　結(jié)果：(1)光凝后14 d，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠較正常小鼠CNV滲漏增加，CNV面積和直徑增大，厚度無(wú)明顯改變，抗氧化劑 NAC可減輕糖尿病小鼠CNV生成的嚴(yán)重程度；(2)光凝后3 d，8-OHdG、p-STAT3和VEGF高表達(dá)于糖尿病小鼠CNV區(qū)域，糖尿病小鼠眼部分泌VEGF含量顯

8、著增高，NAC部分抑制上述因子的過(guò)表達(dá)；(3)高糖培養(yǎng)條件下，RPE細(xì)胞p-STAT3呈高表達(dá)，VEGF mRNA及蛋白含量增加，ROS水平顯著增高。NAC降低了RPE細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并抑制p-STAT3和VEGF的過(guò)表達(dá)，JAK2/STAT3通路抑制劑AG490顯著降低VEGF表達(dá)，但對(duì)ROS水平無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：(1)糖尿病可加重STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)性CNV的嚴(yán)重程度，此過(guò)程中伴隨激光后局部氧化應(yīng)激水平、核轉(zhuǎn)錄蛋