血管內(nèi)皮生長因子及其受體在脊髓與周圍神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)及作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、血管內(nèi)皮生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)是一種強(qiáng)的血管生成肽，具有特異性促內(nèi)皮細(xì)胞分裂原的作用，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生與遷移，誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)新生血管生長。近年來，一系列研究表明，VEGF還可以直接作用于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，刺激它們生長、存活，促進(jìn)軸突再生。因?yàn)閂EGF的這種雙重特性，故可以將其局部應(yīng)用來治療周圍神經(jīng)損傷。但VEGF蛋白價(jià)格昂貴，并且在體內(nèi)不穩(wěn)定，極易被降解。直接應(yīng)用于

2、損傷神經(jīng)局部可操作性不強(qiáng)。鑒于此些因素，本實(shí)驗(yàn)首先對VEGF與其受體在神經(jīng)組織中的表達(dá)情況做以檢測，其次探討采用基因治療的方法，局部注射VEGF質(zhì)粒(phVEGF165)治療周圍神經(jīng)損傷的可行性及其療效。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1)觀察大鼠脊髓與脊神經(jīng)節(jié)組織中VEGF與其受體VEGFR-1，VEGFR-2的表達(dá)，以及它們在大鼠坐骨神經(jīng)切斷后表達(dá)的變化規(guī)律，并探討這種變化的意義。 (2)檢測VEGFR-1，VEGFR-2在大鼠坐骨神

3、經(jīng)與培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞中的表達(dá)與分布，以及對VEGF促周圍神經(jīng)損傷后再生作用的機(jī)制進(jìn)行初步探討。 (3)檢測在大鼠損傷的坐骨神經(jīng)局部注射VEGF真核表達(dá)載體(phVEGF165)后，VEGF蛋白的表達(dá)情況，并探討應(yīng)用此法治療大鼠坐骨神經(jīng)損傷的可行性。 研究技術(shù)路線：(1)取成年雄性Wistar大鼠80只，隨機(jī)分成8組。對照組10只，僅切開暴露坐骨神經(jīng)而不切斷。實(shí)驗(yàn)組70只，在大鼠切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)后8h、24h、72h、5d、

4、7d、10d、14d取腰4-腰6節(jié)段脊髓與相應(yīng)脊神經(jīng)節(jié)組織，采用免疫組織化學(xué)方法，WesternBlot免疫印跡與圖像分析技術(shù)，對VEGF及其VEGFR-1，VEGFR-2受體的表達(dá)進(jìn)行檢測，并與對照組的表達(dá)水平相比較分析其變化規(guī)律。 (2)采用免疫組織化學(xué)方法與WesternBlot免疫印跡及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，檢測成年雄性Wistar大鼠坐骨神經(jīng)與培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞中，VEGFR-1與VEGFR-2蛋白及mRNA的表達(dá)。

5、 (3)成年雄性Wistar大鼠75只，建立雙側(cè)坐骨神經(jīng)損傷模型。隨機(jī)分為三組：A組局部注射生理鹽水為對照組；B組局部注射25μgphVEGF165；C組局部注射50μgphVEGF165。術(shù)后分別于24、48小時(shí)，每組各取5只大鼠通過免疫組化、Westernblot技術(shù)檢測VEGF在損傷神經(jīng)局部的表達(dá)情況。然后于術(shù)后4、6、8周每組取5只大鼠通過檢測腓腸肌濕重、電生理和組織形態(tài)學(xué)及圖象分析，評估神經(jīng)的再生與功能恢復(fù)情況。

6、 研究結(jié)果：(1)大鼠正常脊髓與脊神經(jīng)節(jié)組織中均存在VEGF及VEGFR-1，VEGFR-2的表達(dá)，并且VEGFR-2在脊髓白質(zhì)中的神經(jīng)纖維及膠質(zhì)細(xì)胞也有所表達(dá)。在坐骨神經(jīng)切斷后VEGF及VEGFR-2的表達(dá)水平可反應(yīng)性地增強(qiáng)，持續(xù)一段時(shí)間后迅速回落至正常水平，但VEGFR-1表達(dá)隨時(shí)間變化的趨勢不明顯。 (2)在培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞中可以見到VEGFR-1與VEGFR-2的表達(dá)。在大鼠坐骨神經(jīng)的神經(jīng)中，VEGFR-1與VEGFR-

7、2的表達(dá)分布于神經(jīng)內(nèi)膜、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，并且VEGFR-2也存在于坐骨神經(jīng)的軸索內(nèi)。 (3)局部注射phVEGF16524、48小時(shí)后，B、C組大鼠損傷部位神經(jīng)的神經(jīng)內(nèi)膜均明顯表達(dá)VEGF，A組大鼠鮮見VEGF陽性產(chǎn)物產(chǎn)生。Westernblot免疫印跡分析結(jié)果顯示B、C組VEGF的表達(dá)水平均明顯高于A組，且C組高于B組。 (4)4周時(shí)，各組神經(jīng)再生的情況沒有明顯差別。6、8周時(shí)B、C組大鼠的腓腸肌濕重、組織形態(tài)學(xué)、

8、圖象分析及電生理等指標(biāo)的結(jié)果均明顯好于A組，且C組好于B組。 結(jié)論：(1)大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元與脊神經(jīng)節(jié)反射性分泌的VEGF對神經(jīng)元胞體起著一定的保護(hù)作用，在介導(dǎo)VEGF的神經(jīng)營養(yǎng)作用時(shí)VEGFR-2顯得更為重要。并且，這些分泌性VEGF蛋白可以通過軸突運(yùn)輸?shù)姆绞降竭_(dá)坐骨神經(jīng)損傷部位，作用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及神經(jīng)內(nèi)膜雪旺細(xì)胞上的VEGFR-1、VEGFR-2受體，發(fā)揮促血管生長與神經(jīng)營養(yǎng)作用。 (2)