中藥溪黃草有效成分Nodosin對移植肝雙重保護機制的實驗研究.pdf

1、目的：①探討中藥溪黃草有效成分Nodosin對小鼠脾臟來源T淋巴細胞增殖的影響。②探討體外灌注中藥溪黃草有效成分Nodosin對大鼠供肝保護性基因血紅素加氧酶-1(HO-1)表達的影響。③探討中藥溪黃草有效成分Nodosin以體外保留灌注的方式保護供肝功能的可行性。 方法：⑴建立體外由刀豆蛋白A(ConA)誘導的BALB/c小鼠脾臟淋巴細胞的增殖模型。采用MTT法，以Nodosin濃度梯度分別為3.125μg/ml、6.25μg

2、/ml、12.5μg/ml和25μg/ml繪制淋巴細胞的生長曲線。⑵建立體外由刀豆蛋白A(ConA)誘導的BALB/c小鼠脾臟淋巴細胞的增殖模型。設立空白對照組、ConA組和實驗組。將實驗組分為Nodosin高劑量組(濃度為25μg/ml)，中劑量組(濃度為12.5μg/ml)，低劑量組(濃度為6.25μg/ml)。各組經(jīng)實驗藥物作用后，用流式細胞儀分選CD4+、CD8+、CD4+CD25+細胞亞群，觀察Nodosin對淋巴細胞亞群的抑

3、制作用。⑶建立Nodosin體外保留灌注大鼠肝臟的實驗模型。采用Westernblot測定肝組織中HO-1蛋白表達變化；RT-PCR法測定肝組織中HO-1 mRNA的表達；膽紅素生成試驗測定HO-1的酶活性改變。⑷建立Nodosin體外保留灌注大鼠肝臟的實驗模型。實驗組分為Nodosin高劑量組(濃度為200μg/ml)，中劑量組(濃度為20μg/ml)，低劑量組(濃度為10μg/ml)和空白對照組(即平衡液灌注)。采用Banff法評估

4、體外保留灌注Nodosin的離體大鼠肝臟的病理損傷；電鏡下評估肝臟細微結構的損傷情況。⑸建立使用Nodosin保留灌注供肝行大鼠原位肝移植的實驗模型。實驗設立空白對照組，Nodosin組(濃度為200μg/ml)，ZnPP組(濃度為500μg/ml)和CoPP組(濃度為125μg/ml)。分別于移植術后1、3、7、21天獲取肝臟病理組織，采用suzuki法評估移植肝的病理損傷；排斥活動指數(shù)(rejection activity inde

5、x，RAI)評分系統(tǒng)劃分排斥的嚴重程度；生物化學法檢測移植后1、3、7、21天血清ALT，AST，評估肝功能損傷情況。 結果：①Nodosin可以顯著抑制ConA抗原刺激下的T細胞增殖，并具有濃度依賴性。各實驗組之間存在顯著的統(tǒng)計學差異。②Nodosin對CD8+T細胞亞群的增殖有顯著的抑制作用。Nodosin各濃度組與ConA組之間均有顯著的統(tǒng)計學差異，p<0.01。而且Nodosin-H組與Nodosin-M組和Nodosi

6、n-L組之間也有顯著的統(tǒng)計學差異。③Nodosin對CD4+T細胞以及CD4+CD25+T淋巴細胞亞群的增殖無明顯抑制作用。④灌注后1h，Nodosin中劑量組、高劑量組和CoPP組HO-1的mRNA、蛋白表達以及酶活性均高于空白對照組，其差別有統(tǒng)計學意義。p<0.05；而ZnPP組均低于空白對照組，其差別有統(tǒng)計學意義。⑤灌注后2h，Nodosin各濃度組HO-1的mRNA、蛋白表達以及酶活性較灌注1h均有降低。⑥Nodosin各濃度組

7、的Banff評分與空白對照組相比沒有明顯的統(tǒng)計學差異。電鏡下，高劑量Nodosin保留灌注2小時的大鼠肝組織結構無明顯破壞。⑦各實驗組隨著存活天數(shù)的延長，移植肝的suzuki評分均逐漸上升。但移植后1、3、7天各組的suzuki評分無統(tǒng)計學差異；移植術后21天Nodosin組和CoPP組的suzuki評分優(yōu)于空白對照組，而ZnPP組的評分差于空白對照組和Nodosin組。⑧各實驗組隨著存活天數(shù)的延長，各組移植肝的RAI評分均逐漸上升。移

8、植后1、3天Nodosin組的RAI評分與空白對照組無統(tǒng)計學差異，但明顯優(yōu)于ZnPP組，兩者間的差異有統(tǒng)計學意義，p<0.05。移植術后7、21天Nodosin組的RAI評分優(yōu)于空白對照組和ZnPP組。⑨各實驗組ALT和AST均呈逐漸下降趨勢。CoPP組的ALT和AST明顯低于其他各組，其間的差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。p<0.05。Nodosin組的ALT和AST亦低于空白對照組，但僅在移植術后3天的ALT值與空白對照組相比有統(tǒng)計學意義

9、。 結論：⑴中藥溪黃草有效成分Nodosin對ConA誘導的BALB/c小鼠脾臟淋巴細胞增殖有抑制作用，尤其是顯著減少CD8+T淋巴細胞亞群的數(shù)量，作用呈效應-濃度依賴趨勢。提示Nodosin可能在移植術后抑制移植物內(nèi)的淋巴細胞增殖浸潤，從而在移植后肝功能的保護方面起一定的作用。⑵中藥溪黃草有效成分Nodosin體外保留灌注的大鼠肝臟，可以上調(diào)肝組織的HO-1在核酸水平、蛋白水平的表達，增加HO-1的酶活性，從而使供肝具備對抗移

10、植后肝臟組織損傷的能力。同時，Nodosin上調(diào)肝組織HO-1的作用在保留灌注后l小時最強，與動物模型中通常的冷缺血時間基本相符，有利于對移植肝再灌注損傷的保護。⑶以中藥溪黃草有效成分Nodosin體外保留灌注大鼠供肝是安全的；Nodosin能減輕移植肝內(nèi)淋巴細胞的增殖浸潤，并在Nodosin200μg/ml劑量下保留灌注的大鼠供肝具有減輕移植術后的移植肝病理和肝功能損害的趨勢。這可能與Nodosin抑制大鼠肝臟內(nèi)淋巴細胞增殖和上調(diào)HO