秈稻成熟胚再生體系的建立及反義waxy基因轉(zhuǎn)化秈稻的研究.pdf

1、水稻是我國(guó)的主要糧食作物之一，其播種面積占全部糧食作物面積的30％，產(chǎn)量則占糧食總產(chǎn)量的40％。由于糧食的不斷增產(chǎn)和人民生活水平的提高，人們對(duì)稻米的要求逐步從量的需要轉(zhuǎn)向質(zhì)的要求，米飯的食味品質(zhì)備受關(guān)注。湖南作為我國(guó)稻米的主要產(chǎn)區(qū)之一，絕大部分水稻品種的直鏈淀粉含量偏高，品質(zhì)較差，嚴(yán)重影響了稻米的出口，因此，盡快改良我省稻米的直鏈淀粉含量已成為一項(xiàng)極其重要且十分緊迫的任務(wù)。運(yùn)用基因工程手段培育轉(zhuǎn)基因水稻為傳統(tǒng)水稻育種和遺傳改良開(kāi)辟了新的

2、途徑。本研究以3個(gè)秈稻品種的成熟胚為材料，建立了適合于秈稻愈傷組織的誘導(dǎo)和再生體系。通過(guò)對(duì)水稻愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中的生理生化特性進(jìn)行的研究，優(yōu)化了農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化條件，并將外源蠟質(zhì)反義片段和抗潮霉素抗性基因共轉(zhuǎn)化湘早秈33號(hào)和01早5202愈傷組織，經(jīng)過(guò)抗性篩選和植株再生，得到了既含目的基因又含標(biāo)記基因的共轉(zhuǎn)化植株。研究結(jié)果如下：1.秈稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和再生體系的建立。三種水稻組織培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基(MS、N6、CC)對(duì)愈傷組織誘

3、導(dǎo)率影響不大，但以N6培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織質(zhì)量較好，而CC培養(yǎng)上培養(yǎng)的愈傷組織分化率較高。在實(shí)驗(yàn)中，選擇以N6培養(yǎng)基作為秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基，而以CC培養(yǎng)基作為愈傷組織分化的基本培養(yǎng)基。2,4-D是植物組織培養(yǎng)中最常用的愈傷組織誘導(dǎo)劑，但其濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于水稻愈傷組織的誘導(dǎo)，在N6基本培養(yǎng)基上添加1.5～2mg·L-1的2,4-D能有效地誘導(dǎo)供試材料成熟胚愈傷組織的形成。適當(dāng)濃皮的6-BA(0.2～0.4mg·L-1)能

4、改善愈傷組縱的質(zhì)量，提高其植株再生頻率，但過(guò)高濃度的6-BA會(huì)對(duì)愈傷組織產(chǎn)生毒害作用。 2.細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和形態(tài)建成的方向取決于其生理和生化的變化。秈稻愈傷組織在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)有規(guī)律的變化。在愈傷組織旺盛生長(zhǎng)過(guò)程中，其可溶性蛋白含量明顯提高，可溶性蛋白組分電泳條帶增多。愈傷組織在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，蛋白合成明顯增加，可溶性蛋白含量分別在分化培養(yǎng)的第6d和第12d出現(xiàn)峰值，而此時(shí)正是愈傷組織形態(tài)發(fā)生明顯變化的時(shí)期

5、。這表明，蛋白質(zhì)的活躍合成為器官的形態(tài)建成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中某些保護(hù)酶活性及其同工酶的變化反映了其細(xì)胞內(nèi)自由基代謝的規(guī)律。PPO活性高低與愈傷組織褐化程度有關(guān)。POD和SOD活性的高低反映了細(xì)胞內(nèi)代謝的旺盛程度。POD活性高的繼代培養(yǎng)愈傷組織對(duì)農(nóng)桿菌更為敏感，適宜于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。POD、CAT和SOD等保護(hù)酶活性變化與維持分化培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織細(xì)胞內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。當(dāng)它們出現(xiàn)峰值時(shí)，細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)也最為活躍。保護(hù)酶

6、同工酶酶譜的變化與秈稻愈傷組織分化進(jìn)程緊密相關(guān)。愈傷組織分化過(guò)程中，保護(hù)酶同工酶酶譜上會(huì)出現(xiàn)某些與其形態(tài)變化相關(guān)的條帶。因此，其同工酶的酶譜特征可作為植物組織培養(yǎng)中的一種生化指標(biāo)。 3.植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞組織的各種變化與內(nèi)源激素的種類(lèi)、水平和配比具有重要關(guān)系，其生理效應(yīng)是不同種類(lèi)激素之間相互作用的結(jié)果。不同植物激素在不同波長(zhǎng)下有吸收峰，通過(guò)波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，IAA和GA3、ABA和Z最大吸收峰波長(zhǎng)相近。在設(shè)定的色譜條件下，它們

7、可以在液相色譜中得到較好的分離。內(nèi)源激素測(cè)定結(jié)果表明，在整個(gè)繼代培養(yǎng)過(guò)程中，內(nèi)源植物激素都保持在較高水平，這可能是秈稻愈傷組織維持細(xì)胞胚性和旺盛代謝的重要因素。IAA、GA3、Z含量變化與愈傷組織生長(zhǎng)速度變化趨勢(shì)基本一致。不同繼代培養(yǎng)時(shí)期的愈傷組織，其內(nèi)源激素水平存在差異，細(xì)胞分裂素含量高，愈傷組織生長(zhǎng)代謝旺盛，有利于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。較高濃度的ABA可能與愈傷組織分化啟動(dòng)和表達(dá)有關(guān)。在愈傷組織分化培養(yǎng)過(guò)程中，伴隨著IAA含量的升高

8、，水稻胚性細(xì)胞開(kāi)始形成，當(dāng)胚性細(xì)胞產(chǎn)生進(jìn)入高峰期時(shí)，IAA含量也達(dá)到峰值。細(xì)胞分裂素含量高低與苗分化有關(guān)，而內(nèi)源GA含量與分化苗的生長(zhǎng)有關(guān)。適宜濃度的ABA是秈稻愈傷組織分化的重要影響因子，高水平的ABA有利于分化芽的形成。ABA/IAA和ABA/GA3比值高低與分化有關(guān)，高ABA/IAA是分化芽大量發(fā)生的重要因素。 4.不同繼代培養(yǎng)時(shí)間的秈稻愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率不同，就供試材料而言，以從種胚剝離后繼代培養(yǎng)12d左右的愈傷組