秈稻成熟胚再生體系的建立及反義waxy基因轉(zhuǎn)化秈稻的研究.pdf

1、水稻是我國的主要糧食作物之一，其播種面積占全部糧食作物面積的30％，產(chǎn)量則占糧食總產(chǎn)量的40％。由于糧食的不斷增產(chǎn)和人民生活水平的提高，人們對稻米的要求逐步從量的需要轉(zhuǎn)向質(zhì)的要求，米飯的食味品質(zhì)備受關注。湖南作為我國稻米的主要產(chǎn)區(qū)之一，絕大部分水稻品種的直鏈淀粉含量偏高，品質(zhì)較差，嚴重影響了稻米的出口，因此，盡快改良我省稻米的直鏈淀粉含量已成為一項極其重要且十分緊迫的任務。運用基因工程手段培育轉(zhuǎn)基因水稻為傳統(tǒng)水稻育種和遺傳改良開辟了新的

2、途徑。本研究以3個秈稻品種的成熟胚為材料，建立了適合于秈稻愈傷組織的誘導和再生體系。通過對水稻愈傷組織培養(yǎng)過程中的生理生化特性進行的研究，優(yōu)化了農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化條件，并將外源蠟質(zhì)反義片段和抗潮霉素抗性基因共轉(zhuǎn)化湘早秈33號和01早5202愈傷組織，經(jīng)過抗性篩選和植株再生，得到了既含目的基因又含標記基因的共轉(zhuǎn)化植株。研究結(jié)果如下：1.秈稻成熟胚愈傷組織的誘導和再生體系的建立。三種水稻組織培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基(MS、N6、CC)對愈傷組織誘

3、導率影響不大，但以N6培養(yǎng)基上生長的愈傷組織質(zhì)量較好，而CC培養(yǎng)上培養(yǎng)的愈傷組織分化率較高。在實驗中，選擇以N6培養(yǎng)基作為秈稻愈傷組織誘導的基本培養(yǎng)基，而以CC培養(yǎng)基作為愈傷組織分化的基本培養(yǎng)基。2,4-D是植物組織培養(yǎng)中最常用的愈傷組織誘導劑，但其濃度過高或過低都不利于水稻愈傷組織的誘導，在N6基本培養(yǎng)基上添加1.5～2mg·L-1的2,4-D能有效地誘導供試材料成熟胚愈傷組織的形成。適當濃皮的6-BA(0.2～0.4mg·L-1)能

4、改善愈傷組縱的質(zhì)量，提高其植株再生頻率，但過高濃度的6-BA會對愈傷組織產(chǎn)生毒害作用。 2.細胞生長、分化和形態(tài)建成的方向取決于其生理和生化的變化。秈稻愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)有規(guī)律的變化。在愈傷組織旺盛生長過程中，其可溶性蛋白含量明顯提高，可溶性蛋白組分電泳條帶增多。愈傷組織在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，蛋白合成明顯增加，可溶性蛋白含量分別在分化培養(yǎng)的第6d和第12d出現(xiàn)峰值，而此時正是愈傷組織形態(tài)發(fā)生明顯變化的時期

5、。這表明，蛋白質(zhì)的活躍合成為器官的形態(tài)建成奠定了物質(zhì)基礎。愈傷組織培養(yǎng)過程中某些保護酶活性及其同工酶的變化反映了其細胞內(nèi)自由基代謝的規(guī)律。PPO活性高低與愈傷組織褐化程度有關。POD和SOD活性的高低反映了細胞內(nèi)代謝的旺盛程度。POD活性高的繼代培養(yǎng)愈傷組織對農(nóng)桿菌更為敏感，適宜于進行遺傳轉(zhuǎn)化。POD、CAT和SOD等保護酶活性變化與維持分化培養(yǎng)過程中愈傷組織細胞內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡有關。當它們出現(xiàn)峰值時，細胞內(nèi)代謝活動也最為活躍。保護酶

6、同工酶酶譜的變化與秈稻愈傷組織分化進程緊密相關。愈傷組織分化過程中，保護酶同工酶酶譜上會出現(xiàn)某些與其形態(tài)變化相關的條帶。因此，其同工酶的酶譜特征可作為植物組織培養(yǎng)中的一種生化指標。 3.植物組織培養(yǎng)過程中，細胞組織的各種變化與內(nèi)源激素的種類、水平和配比具有重要關系，其生理效應是不同種類激素之間相互作用的結(jié)果。不同植物激素在不同波長下有吸收峰，通過波長掃描發(fā)現(xiàn)，IAA和GA3、ABA和Z最大吸收峰波長相近。在設定的色譜條件下，它們

7、可以在液相色譜中得到較好的分離。內(nèi)源激素測定結(jié)果表明，在整個繼代培養(yǎng)過程中，內(nèi)源植物激素都保持在較高水平，這可能是秈稻愈傷組織維持細胞胚性和旺盛代謝的重要因素。IAA、GA3、Z含量變化與愈傷組織生長速度變化趨勢基本一致。不同繼代培養(yǎng)時期的愈傷組織，其內(nèi)源激素水平存在差異，細胞分裂素含量高，愈傷組織生長代謝旺盛，有利于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化。較高濃度的ABA可能與愈傷組織分化啟動和表達有關。在愈傷組織分化培養(yǎng)過程中，伴隨著IAA含量的升高

8、，水稻胚性細胞開始形成，當胚性細胞產(chǎn)生進入高峰期時，IAA含量也達到峰值。細胞分裂素含量高低與苗分化有關，而內(nèi)源GA含量與分化苗的生長有關。適宜濃度的ABA是秈稻愈傷組織分化的重要影響因子，高水平的ABA有利于分化芽的形成。ABA/IAA和ABA/GA3比值高低與分化有關，高ABA/IAA是分化芽大量發(fā)生的重要因素。 4.不同繼代培養(yǎng)時間的秈稻愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率不同，就供試材料而言，以從種胚剝離后繼代培養(yǎng)12d左右的愈傷組