冷血漿停搏液對幼兔缺血-再灌注損傷心肌心臟功能的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、 心肌持續(xù)性缺血可導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡，盡管早期再灌注對組織非常重要，但再灌注后血液循環(huán)中白細(xì)胞附壁、聚積、滲出血管而浸潤心肌，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，加之補(bǔ)體激活以及活性氧的產(chǎn)生，致使缺血性心肌損傷更為嚴(yán)重，即缺血/再灌注損傷(MI/RI)。心臟直視手術(shù)時冠狀動脈血運(yùn)被阻斷，心肌處于缺血乏氧狀態(tài)；當(dāng)手術(shù)結(jié)束心肌恢復(fù)正常血運(yùn)時又導(dǎo)致心肌新的損傷——再灌注損傷。如何最大限度地減輕心肌MI/RI一直是臨床至關(guān)重要的課題。 自19

2、55年Melrose創(chuàng)用高鉀停搏液以來，以高鉀為主要成分的各種改良心肌保護(hù)液不斷研制出來，明顯改善了心肌保護(hù)的效果，提高了心臟手術(shù)的成功率。隨著心臟外科技術(shù)的不斷發(fā)展，先天性心臟病手術(shù)趨向幼齡化和復(fù)雜化。把適合于成熟心肌保護(hù)的停搏液直接應(yīng)用于未成熟心肌保護(hù)是不合適的，缺乏理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。近年來，未成熟心肌保護(hù)已成為心肌保護(hù)研究的熱點(diǎn)之一。本研究中，由影像診斷和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究兩方面進(jìn)行。首先應(yīng)用高頻超聲檢測幼兔的心功能的基本狀態(tài)，以說明幼

3、兔作為未成熟心肌的動物模型，其心肌的順應(yīng)性減低；然后采用幼兔離體缺血/再灌注心臟模型，測定其心肌的含水量以及心臟的冠脈儲備功能；最后通過檢測心肌細(xì)胞中TNF蛋白、TNF mRNA和Bcl—2蛋白表達(dá)的變化，以及心肌細(xì)胞凋亡情況，來探討冷血漿停搏液對未成熟心肌的心臟功能的影響及其產(chǎn)生的機(jī)制，為冷血漿停搏液對未成熟心肌保護(hù)的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 方法： 論文一： 選擇14～26日齡日本大耳白兔，體重350

4、～580g，20只，雌雄不拘(清潔級，中國醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室提供)。腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛3ml/kg全身麻醉幼兔后，幼兔胸部備皮，仰臥位固定，對幼兔進(jìn)行超聲檢查。于胸骨旁左心室長軸二維圖像，在腱索水平將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動圖，根據(jù)ASE推薦法測定舒張末期及收縮末期左心室內(nèi)徑(EDD、ESD)及室間隔(IVS)和后壁厚度(LVPW)。應(yīng)用Teichholtz公式法計算左心室射血分?jǐn)?shù)(EF％)及

5、左心室短軸縮短率(FS％)。于心尖四腔觀，將取樣容積置于二尖瓣瓣尖獲得二尖瓣多普勒血流流速曲線(E，A)并計算E/A；用DTI-PW測定二尖瓣前后葉瓣環(huán)運(yùn)動速度，獲得二尖瓣瓣環(huán)舒張早期速度(Ea)和舒張晚期速度(Aa)并計算Ea/Aa。于心尖五腔心切面將取樣容積放在二尖瓣與左室流出道之間描記多普勒頻譜圖，測量射血時間(ET)，二尖瓣口血流A峰終止處至下一心動周期二尖瓣口血流E峰開始處的時間間隔(a)，a—ET=等容收縮時間(ICT)+等

6、容舒張時間(IRT)，利用公式Tei=(ICT+IRT)/ET=(a—ET)/ET計算出Tei指數(shù)。 論文二： 離體心臟制備與標(biāo)本收集：腹腔注射10％水合氯醛3ml/kg，耳緣靜脈注入肝素150U/kg抗凝，正中開胸摘取心臟，立即浸入4℃的鹽水中，主動脈插管，連接Langendorff灌注裝置，用37℃的K—H液灌注，灌注壓為60 cm H2O(5.88kPa)，灌注10分鐘后收集10分鐘的冠脈流出液。正常對照組立即終止

7、灌注，取右室心肌作檢測用。P組和B組降溫同時開始分別灌注冷血漿停搏液或冷血停搏液(4℃)15ml/kg，灌注壓為60 cm H2O(5.88kPa)。低溫(10℃)停搏30分鐘后，開始復(fù)溫并再灌注37℃K—H液，10分鐘后收集冠脈流出液，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時取右室心肌作檢測用。測定灌注停搏液至心臟機(jī)械停搏時間、心臟停搏前、后工作心的復(fù)跳時間、心率、冠脈流量、心肌含水量。 論文三： 采用免疫組化、原位雜交、TUNEL法和RT-PCR

8、方法檢測心肌組織中TNF蛋白、TNF mRNA和Bcl—2蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。按照試劑盒說明書步驟操作。 結(jié)果： 論文一 1、M型超聲檢測的心功能指標(biāo)：左心室射血分?jǐn)?shù)正常值72.2±3.5％，短軸縮短率正常值37.5±3.0％。 2、多普勒超聲檢測的心功能指標(biāo)：二尖瓣血流頻譜舒張早期峰值流速58.5±6.4cm/s，舒張晚期峰值流速72.6±5.7cm/s，二者之比0.81±0.07；二尖瓣環(huán)舒張

9、早期速度6.8±1.5cm/s，舒張晚期速度8.5±2.3cm/s，二者之比0.84±0.24；Tei指數(shù)0.31±0.05。 論文二 1、灌注冷血漿停搏液和冷血停搏液至心臟機(jī)械停搏時間分別為40.5±2.2秒和80.0±2.0秒，差異顯著(P<0.01)。 2、P組復(fù)跳時間、心率、冠脈流量和心肌含水量分別為46.4±8.7秒、142.4±22.7 bpm、12.3±2.4 ml/min和73％±5％，B組為88

10、.6±10.2秒、122.8±14.7 bpm、6.4±2.2ml/min和82％±14％，差異顯著(P<0.05)；P組與B組復(fù)跳后心率恢復(fù)率及冠脈流量的恢復(fù)率比較，均具有顯著差異(P<0.05)。 論文三 1、在無缺血/再灌注的未成熟心肌組織中沒有TNF蛋白和TNF mRNA表達(dá)，染色呈陰性；但是，在經(jīng)歷缺血/再灌注的實(shí)驗(yàn)組，心肌組織中TNF蛋白和TNFmRNA表達(dá)明顯，P組染色呈弱陽性或陽性，而B組呈強(qiáng)陽性或陽性。

11、 2、在無缺血/再灌注的對照組心肌組織中沒有看到凋亡細(xì)胞；在經(jīng)歷缺血/再灌注的實(shí)驗(yàn)組，出現(xiàn)少量心肌細(xì)胞凋亡。 3、缺血/再灌注損傷可以使心肌組織中Bcl—2 mRNA表達(dá)減弱；對照組心肌組織中Bcl—2蛋白相對含量為0.921±0.015，P組為0.712±0.021，B組為0.504±0.028，差異顯著(P<0.01或P<0.05)。 結(jié)論： 1、幼兔的心功能示心肌順應(yīng)性低，舒張功能減低，收縮功能正常