IL23R、PTPN2、10q21基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性的初步研究.pdf

1、背景、目的 炎癥性腸病(Inflammatoryboweldisease，IBD)包括克羅恩病(Crohn'sdisease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerativecolitis，UC)。近年來IBD的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，特別是CD的發(fā)病率，隨著雙氣囊小腸鏡的應(yīng)用，CD的發(fā)現(xiàn)率逐年上升。以往IBD一直被認(rèn)為是一種自身免疫性疾病，而近年來多個(gè)研究證明IBD特別是CD具有明顯的遺傳易感性。目前較為一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，炎癥性腸病是攜帶遺

2、傳易感基因的宿主在環(huán)境因素作用下，自身免疫功能紊亂導(dǎo)致的一種非特異性炎癥性疾病。因此遺傳因素在炎癥性腸病的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，對(duì)基因研究的重點(diǎn)已由全基因組序列測(cè)定轉(zhuǎn)移到了對(duì)基因組中個(gè)體基因多態(tài)性和功能的研究。個(gè)體基因多態(tài)性的主要形式就是單鏈核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)，SNP被公認(rèn)為繼“限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性”和“微衛(wèi)星多態(tài)性”這兩種遺傳標(biāo)記之后，出現(xiàn)

3、的“第三代DNA遺傳標(biāo)記”，是目前全世界基因研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 2001年歐洲Hugot研究小組及美國(guó)Ogura研究小組幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了人類第一個(gè)CD易感基因NOD2基因，后改名為CARD15，并證實(shí)該基因的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)Arg702tRP、Gly908Arg和Leu1007fsinsC是白種人CD的易感基因，但后來的研究證明此三個(gè)SNP位點(diǎn)與日本人及我國(guó)香港人、浙江人CD患者無關(guān)。我們也對(duì)廣東地區(qū)CD患者NO

4、D2基因的三個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其與CD無顯著相關(guān)，并通過基因測(cè)序的方法發(fā)現(xiàn)了可能與中國(guó)人CD密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)P268S，并成功構(gòu)建了該位點(diǎn)的突變型真核表達(dá)載體，為后續(xù)功能的研究打下了基礎(chǔ)。最近西方多個(gè)研究小組通過全基因掃描的方法分別對(duì)歐洲高加索人、猶太人、英國(guó)、法國(guó)、巴爾干、德國(guó)、加拿大(魁北克)等地區(qū)的IBD患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了一些與IBD，特別是CD患者密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)，主要位于IL23R、ATG16L1、PTPN2、

5、10q21、NKX2、IRGM、MST1、DLG5、OCTN1、5p31等基因中。其中位于IL23R基因中的rs11209026、rs11805303位點(diǎn)、PTPN2基因中的rs2542151和位于染色體10q21中的rs10761659SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義較為明顯；rs11209026位于IL23R基因的第10外顯子中，正常為G，突變?yōu)锳，導(dǎo)致381位的氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)楣劝滨０?Gin)，Duerr等人研究的結(jié)果認(rèn)為該SN

6、P位點(diǎn)與歐洲白種人CD患者顯著相關(guān)(P=1.56×10-3)，其OR值為0.26(猶太人為0.47)；rs11805303位于IL23R基因第7和第8外顯子之間的內(nèi)含子之中，正常為C，突變?yōu)門，該堿基的改變?cè)黾恿宋鞣饺薈D發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，雜合突變的OR值為1.39，純合突變的OR值為1.86；rs2542151位于PTPN2基因上游約5.5kb的區(qū)域中，可能為PTPN2基因的啟動(dòng)子區(qū)或者上游控制元件，PTPN2基因編碼一種關(guān)鍵的炎癥負(fù)性調(diào)節(jié)

7、因子-T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶(Tcellproteintyrosinephosphatase，TCPTP)，在西方IBD患者當(dāng)中，其危險(xiǎn)等位基因?yàn)镚，雜合子的OR值為1.3(1.14-1.48)，純合子的OR值為2.01(1.46-2.76)，rs10761659位于10q21的基因間區(qū)，其危險(xiǎn)等位基因?yàn)镚，其雜合子的OR值為1.23(1.05-1.45)，純合子的OR值為1.55(1.30-1.84)。 本研究的目的通過基因測(cè)

8、序和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的方法探索與西方白種人及猶太人CD患者密切相關(guān)的上述四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與IBD患者發(fā)病易感性的相關(guān)性，及其與臨床特征的關(guān)系，為進(jìn)一步研究IBD的發(fā)病機(jī)制及探索IBD易感基因打下基礎(chǔ)，并有可能為臨床治療IBD提供一種新的基因治療靶點(diǎn)。 材料和方法： 1、收集南方醫(yī)院消化科及普外科確診，臨床資料完整，彼此無血源關(guān)系的廣東及外省籍CD患者40例(包括前期收集病例24例和新收病例16例)，UC患者40例(所選

9、患者均為手術(shù)或者內(nèi)鏡下確診的病例，并除外合并其它自身免疫性疾病)，所選患者中男52例，女28例；平均年齡34歲；健康對(duì)照組(Healthycontrol，HC)取門診健康體檢者50例，其中男32例，女18例，平均年齡35歲；所有研究對(duì)象均抽取外周血5ml。 2、應(yīng)用特異性結(jié)合DNA的硅基質(zhì)材料離心吸附柱法和獨(dú)特的洗脫緩沖液系統(tǒng)抽提血液基因組DNA(按試劑盒說明書操作)，抽提成功后DNA產(chǎn)物-70℃保存。 3、針對(duì)上述四個(gè)

10、SNP位點(diǎn)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，PCR方法擴(kuò)增包含這四個(gè)SNP位點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察以確保目的片段擴(kuò)增成功，然后采用切膠純化試劑盒(TIANGEN公司提供)將目的片段純化回收，分光光度計(jì)檢測(cè)純化產(chǎn)物濃度。 4、將純化產(chǎn)物分別采用DNA直接測(cè)序法和聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphismpolymeras

11、echainreactionproducts，PCR-RFLP)進(jìn)行研究；測(cè)序結(jié)果用chromas231判讀SNP位點(diǎn)的基因型。酶切產(chǎn)物以2.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判讀SNP位點(diǎn)的基因型。采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算四個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1、IL23R(rs11209026和rs11805303)基因多態(tài)性與炎癥性腸病發(fā)病的相關(guān)性： 通過DNA測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)中國(guó)人部分

12、CD患者位于IL23R中的這兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率與健康對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；rs11805303位點(diǎn)基因型頻率UC組與HC組比較，P>0.05，差異無顯著性；而等位基因頻率比較，P<0.05(Fisher精確概率檢驗(yàn)P=0.024)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但rs11805303位點(diǎn)基因多態(tài)性與中國(guó)部分UC患者的性別、疾病的活動(dòng)性及發(fā)病部位比較P值均大于0.05；提示rs11805303位點(diǎn)的多態(tài)性

13、可能與中國(guó)部分UC患者有相關(guān)性。 2、PTPN2(r$2542151)和10q21(rsl0761659)基因多態(tài)性與炎癥性腸病發(fā)病的相關(guān)性： 通過聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)，結(jié)果顯示：①PTPN2(rs2542151)位點(diǎn)：CD組基因型頻率、等位基因頻率和基因攜帶者頻率分別與HC組比較P值均大于0.05，而UC組基因型頻率和等位基因頻率與HC比較P<0.05(分別為：0.002和0.00

14、6)，且3例純合子GG均出現(xiàn)于UC患者，提示該位點(diǎn)可能與中國(guó)部分UC患者的發(fā)病易感性有關(guān)。②10q21(rs10761659)位點(diǎn)：UC組的基因型頻率、等位基因頻率和基因攜帶者頻率分別與HC組比較P值均大于0.05，CD組等位基因頻率與HC組比較P值也大于0.05，而基因型頻率與HC組比較P=0.044，提示該位點(diǎn)可能與中國(guó)UC患者易感性無關(guān)，但該位點(diǎn)基因型可能與中國(guó)部分CD患者有相關(guān)性。但這兩個(gè)位點(diǎn)與相應(yīng)疾病的臨床特征均無顯著相關(guān)(P

15、值均大于0.05)。 結(jié)論： 1、IL23R中兩個(gè)與西方人CD密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)(rs11209026和rs11805303)的基因多態(tài)性與中國(guó)部分CD患者的發(fā)病無顯著相關(guān)性，而rs11805303位點(diǎn)的多態(tài)性可能與中國(guó)部分UC患者有相關(guān)性，且該堿基的改變降低了UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但這個(gè)SNP位點(diǎn)基因多態(tài)性與UC患者的病變特點(diǎn)并無顯著相關(guān)； 2、位于PTPN2基因上游區(qū)域中的rs2542151位點(diǎn)可能是中國(guó)部分UC