OCTN1、OCTN2及TNFα基因多態(tài)性與炎癥性腸病相關(guān)性的研究.pdf

1、背景和目的： 炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）包括克羅恩病（Crohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）。近年來IBD的發(fā)病率尤其是CD的發(fā)病率呈上升趨勢，隨著雙氣囊小腸鏡的應(yīng)用，CD的檢出率逐年上升。以往一直認(rèn)為IBD是一種自身免疫性疾病，而近年來諸多研究證明IBD特別是CD具有明顯的遺傳易感性。目前較為一致的觀點認(rèn)為，炎癥性腸病是

2、攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素作用下，自身免疫功能紊亂導(dǎo)致的一種非特異性炎癥性疾病。因此遺傳因素在炎癥性腸病的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。隨著人類基因組計劃的完成，對基因研究的重點已由全基因組序列測定轉(zhuǎn)移到了對基因組中個體基因多態(tài)性和功能的研究。個體基因多態(tài)性的主要形式是單鏈核苷酸多態(tài)性（Singl enucleotide polymorphism，SNP），SNP被公認(rèn)為繼“限制性片段長度多態(tài)性”和“微衛(wèi)星多態(tài)性”這兩種遺傳標(biāo)記之

3、后出現(xiàn)的“第三代DNA遺傳標(biāo)記”，是目前全世界基因研究領(lǐng)域的熱點之一。 2001年歐洲Hugot研究小組及美國Ogura研究小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)了人類第一個CD易感基因NOD2基因，后改名為CARD15，并證實該基因的3個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點Arg702Trp、Gly908Arg和Leu1007fsinsC是白種人CD的易感基因，但后續(xù)的研究證明此三個SNP位點與日本人及我國香港人、浙江人CD患者無關(guān)。我們課題組對廣東地區(qū)C

4、D患者NOD2基因的上述三個SNP位點進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其與CD無顯著相關(guān)，但通過基因測序的方法發(fā)現(xiàn)了可能與中國人CD密切相關(guān)的P268S位點，并已成功構(gòu)建了該位點的突變型真核表達(dá)載體。此后，西方多個研究小組通過全基因掃描的方法分別對歐洲高加索人、猶太人、英國、法國、巴爾干、德國、加拿大（魁北克）等地區(qū)的IBD患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了一些與IBD，特別是CD患者密切相關(guān)的SNP位點，主要位于OCTN1、OCTN2、TNFα、IL23R、 ATG1

5、6L1、PTPN2、10q21、NKX2、IRGM、MST1、DLG5、5p31等基因中。其中位于OCTN1基因中的rs1050152位點、OCTN2基因中的rs2631367位點和位于TNFα基因中的G-308A位點具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。rs1050152位于OCTN1基因第9外顯子中，正常為C，突變?yōu)門，導(dǎo)致第503位的氨基酸由亮氨酸（Leu）變成苯丙氨酸（Phe），而影響對肉毒堿的轉(zhuǎn)運，使細(xì)胞內(nèi)肉毒堿含量下降，導(dǎo)致脂肪酸氧化受抑，

6、能量產(chǎn)生不足，最終出現(xiàn)細(xì)胞代謝紊亂；rs2631367位于OCTN2基因啟動子區(qū)，正常為G，突變?yōu)镃，其發(fā)病機(jī)制可能是該突變破壞了OCTN2基因的熱休克元件（heart shock element），從而影響肉毒堿的轉(zhuǎn)運，Peltekova等首次報道了以上兩個SNP位點與歐洲CD患者明顯相關(guān)，存在其中一個突變可使CD的患病風(fēng)險提高2．5倍，同時具有兩個變異發(fā)病風(fēng)險提高4倍；G-308A位于TNFα基因啟動子區(qū)，Wilson等首先報道了T

7、NFα基因啟動子區(qū)域內(nèi)-308位點的雙等位基因多態(tài)性，各項研究表明TNFα在IBD的發(fā)病中起重要作用，G-308A位點多態(tài)性可影響TNFα的生物學(xué)作用從而可能參與IBD的發(fā)病。 本研究目的是通過基因測序和限制性片段長度多態(tài)性的方法初步探索與西方人CD患者相關(guān)的上述三個多態(tài)性位點與中國部分漢族人IBD患者的相關(guān)性，進(jìn)一步為IBD的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，并有可能為臨床治療IBD提供一種新的基因治療靶點。 材料和方法：

8、 1.收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科及普外科確診、臨床資料完整、彼此無血緣關(guān)系的廣東及外省籍（湖南、湖北、江西、福建、廣西等）CD和UC患者（診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2007年制定的IBD診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均除外合并其他自身免疫性疾病）各45例。UC患者中病變位于直腸6例，左半結(jié)腸12例，右半結(jié)腸6例，全結(jié)腸21例，其中男26例、女19例，平均年齡（35．58±15．81）歲；CD患者中病變部位位于小腸19例，結(jié)腸14例，小腸合并結(jié)腸9例，直腸3例

9、，其中男28例、女17例，平均年齡（32，91±10．54）歲。對照組取門診健康體檢者50例，其中男32例、女18例，平均年齡（37．62±12．62）歲。所有研究對象均抽取外周血5ml。 2.CD、UC及健康對照組均于清晨空腹抽取外周靜脈血5ml置于加入枸櫞酸鈉的抗凝管中，-20℃保存。按TIANGEN公司提供的試劑盒說明書操作，應(yīng)用特異性結(jié)合DNA的硅基質(zhì)材料離心吸附柱法提取血液白細(xì)胞基因組DNA，提取成功后置-70℃保存。

10、 3.針對上述三個SNP位點用Primer5．0軟件設(shè)計PCR引物，PCR方法擴(kuò)增分別包含這三個SNP位點在內(nèi)的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物以1．5%瓊脂糖凝膠電泳觀察以確保目的片段擴(kuò)增成功，然后采用切膠純化試劑盒（TIANGEN公司提供）將目的片段純化回收，并用分光光度計檢測純化產(chǎn)物濃度。 4.將純化產(chǎn)物分別采用DNA直接測序法和聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length p

11、olymorphism polymerase chain reaction products，PCR-RFLP）進(jìn)行研究；測序結(jié)果用chromas2判讀SNP位點的基因型。酶切產(chǎn)物以2．0%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判讀SNP位點的基因型。采用基因計數(shù)法計算三個SNP位點基因型頻率和等位基因頻率，最后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果： 1.OCTN1基因多態(tài)性位點rs1050152與中國部分漢族炎癥性腸病的相關(guān)性： 通過

12、DNA測序發(fā)現(xiàn)，OCTN1基因第9外顯子上的rs1050152位點只有少數(shù)發(fā)生雜合突變（CT），所有三組研究對象均未發(fā)現(xiàn)純合突變（TT），其中CD組有3例，UC組有4例，健康對照組有6例發(fā)生雜合突變，以上發(fā)生突變的樣本均通過反向測序驗證。CD患者該位點基因型頻率為6．7%，等位基因頻率為3．3%，UC患者該位點基因型頻率為8．9%，等位基因頻率為4．4%。CD組、UC組與對照組該位點基因型頻率和等位基因頻率（12．0%和6．0%）比較三

13、組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（x2值分別=0．812和0．770；P值分別=0．715和0．727）。提示rs1050152位點的多態(tài)性可能與中國漢族人群IBD無明顯相關(guān)性。 2.OCTN2基因多態(tài)性位點rs2631367與中國部分漢族炎癥性腸病的相關(guān)性： DNA測序發(fā)現(xiàn)CD患者、UC患者及健康對照者該位點基因型均全部為野生型純合子GG，即未發(fā)現(xiàn)G-207C突變型基因型。提示rs2631367位點的多態(tài)性可能與中國漢族人群I

14、BD無明顯相關(guān)性。 3.TNFα基因多態(tài)性位點G-308A與中國部分漢族炎癥性腸病的相關(guān)性： 通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），CD患者、UC患者及健康對照者該位點基因型均全部為野生型純合子GG，即未發(fā)現(xiàn)G-308A突變型基因型。提示G-308A位點的多態(tài)性可能與中國漢族人群IBD無明顯相關(guān)性。 結(jié)論： 1.國外報道的與西方人CD易感性相關(guān)的OCTN1基因多態(tài)性位點rs105