毛冬青中烏蘇烷型三萜皂苷生物合成相關(guān)基因的發(fā)掘.pdf

1、毛冬青Ilex pubescens Hook.et Arn.為冬青科冬青屬植物，民間常以根或葉入藥，用于治療心絞痛，心肌梗死，脈管炎等疾病。烏蘇烷型三萜及其皂苷是毛冬青的主要特征成分，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明這類成分具有抗癌、抗血栓、保肝等多種生理活性。然而，來源不足、植化分離困難等原因嚴(yán)重限制了人們對這類成分的進(jìn)一步研究與開發(fā)。近年來迅速發(fā)展的合成生物學(xué)為方便地獲得毛冬青三萜皂苷指出了一個(gè)新的方向，而開展相關(guān)研究的關(guān)鍵在于獲得參與毛冬青三萜皂

2、苷生物合成的關(guān)鍵元件。目前對毛冬青三萜皂苷生物合成途徑的了解不多，尤其是下游途徑中的關(guān)鍵酶細(xì)胞色素CYP450單加氧酶(P450)和尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)。P450和UGT均來自超基因家族，參與植物體內(nèi)多種生命活動(dòng)，鑒定困難，需要綜合利用多種分析手段來最終確認(rèn)可能的目標(biāo)基因，如轉(zhuǎn)錄組分析、比較轉(zhuǎn)錄組分析等。
　　崗梅為毛冬青近緣物種，亦含大量三萜皂苷，化學(xué)結(jié)構(gòu)與毛冬青皂苷相似;穿心蓮為爵床科穿心蓮屬植物，主要含有二萜和黃酮

3、類化學(xué)成分，迄今為止尚未有從中分離出三萜類成分的報(bào)道。本論文首先通過對毛冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，初步篩選出參與毛冬青三萜皂苷生物合成的候選基因;通過對毛冬青、崗梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較分析，富集兩物種共有基因及各物種特有基因，驗(yàn)證毛冬青轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果;最后將毛冬青、崗梅共有基因及穿心蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分別被注釋為編碼P450的單一基因(unigene)進(jìn)行比較分析，富集毛冬青、崗梅共同特有而穿心蓮中不存在的unigene，進(jìn)一步篩選可能參與毛冬青與崗

4、梅特有三萜皂苷生物合成的相關(guān)基因。以下為具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果。
　　1、毛冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)概況
　　利用第二代高通量測序技術(shù)——Illumina HiSeqTM2500對毛冬青轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，獲得一個(gè)包含豐富生物信息的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫容量為6.14 Gb。獲得68，688條unigene，其中32，184條Unigene至少在一個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG)中獲得注釋，注釋率46.86％。

5、>　　2、次生代謝途徑富集分析
　　在毛冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，有128條unigene（約占總unigene的1.53％）被注釋為參與萜類的生物合成息息相關(guān)的5條代謝通路中。其中52條候選unigene可能參與了三萜皂苷生物合成的上游途徑，包括:16條可能參與MVA途徑、18條可能參與MEP途徑和18條可能編碼中間體（如DMAPP、GPP、GGPP和FPP等）合成酶的候選unigene。毛冬青轉(zhuǎn)錄組中被注釋為可能編碼環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶(

6、OSC)、P450和UGT的unigene分別有11條、228條和269條。利用基于已知基因的同源比對等生物信息學(xué)分析方法對它們進(jìn)行進(jìn)一步的分析，推斷有2條OSC、18條P450、1條UGT可能參與三萜皂苷的生物合成途徑，可用于下一步功能鑒定實(shí)驗(yàn)。
　　毛冬青轉(zhuǎn)錄組中還可注釋到與黃酮生物合成相關(guān)的幾乎所有的關(guān)鍵酶基因，推測其與毛冬青中含有的大豆苷元、染料木苷等黃酮類成分相關(guān)。對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行挖掘，大部分轉(zhuǎn)錄因子被注釋為AP2/ERF

7、，BHLH，Myb，WRKY等與次生代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的家族。
　　3、比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　毛冬青與崗梅的轉(zhuǎn)錄組中，大部分Unigene（12，756條）被注釋為兩者共有基因，個(gè)別Unigene被注釋為特有基因。對三萜生物合成相關(guān)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行挖掘，毛冬青在三萜生物合成上游途徑中除了編碼3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)的基因被注釋為特有基因，其余被注釋為共有基因;下游途徑中OSC與UGT基因均被歸類為

8、共有基因，P450中也僅有個(gè)別歸類為不同物種間的特有基因。對黃酮生物合成相關(guān)酶基因進(jìn)行挖掘，除2個(gè)編碼查爾酮合成酶(CHS)的基因被注釋為毛冬青特有基因，4個(gè)編碼黃酮醇合成酶(FLS)基因被注釋為崗梅特有基因外，其余均被注釋為共有基因。
　　將毛冬青、崗梅共有基因以及穿心蓮轉(zhuǎn)錄組中分別被注釋為P450s的Unigene進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，毛冬青轉(zhuǎn)錄組中38條unigene、崗梅中33條unigene，為毛冬青與崗梅共有而穿心蓮

9、不具有的P450s基因。對這部分毛冬青、崗梅共有P450s基因進(jìn)行進(jìn)一步的分析，有望從中發(fā)現(xiàn)毛冬青、崗梅三萜母核氧化修飾相關(guān)的P450s。
　　4、Amyrin synthase編碼基因的克隆和功能分析
　　在11條被注釋為編碼OSC的unigene中，unigene0045736被注釋為β-amyrin合成酶（命名為IpAS1），與本課題組前期已鑒定的IaAS1相似性達(dá)98％。通過零背景快速克隆和Infusion技術(shù)最終構(gòu)

10、建了帶特異性標(biāo)簽(6×HIS)的IpAS1酵母表達(dá)載體，在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl中進(jìn)行表達(dá)和功能分析。Western blot結(jié)果顯示了IpAS1在釀酒酵母中成功表達(dá)，氣相色譜法(GC)和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法證明了IpAS1的功能為催化合成α-amyrin和β-amyrin，二者比例約為5∶1，為多功能OSC基因，其很可能參與毛冬青烏蘇烷型三萜皂苷的生物合成。
　　本論文利用生物信息學(xué)分析