蛋白激酶C-β-銜接蛋白氧化應激通路介導早產(chǎn)兒氧暴露后體內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生的研究.pdf

1、目的:研究早產(chǎn)兒氧暴露后體內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生可能的線粒體氧化應激信號傳導途徑。
　　方法:隨機選擇2012年7月至2012年12月胎齡為34周以下四川醫(yī)科大學附屬醫(yī)院新生兒科住院但未用氧治療的早產(chǎn)兒20例作為對照組，未發(fā)生呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome，RDS)及呼吸衰竭，脈搏血氧飽和度(SpO2)＞85％，暴露于空氣中時間＞48h，住院主要原因為早產(chǎn)兒。并隨機選擇相同時間段置于同一室住院診

2、斷為呼吸衰竭[Ⅰ型呼衰:動脈血氧分壓(PaO2)＜6.67kPa;Ⅱ型呼衰:PaO2＜6.67kPa，動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)＞6.67kPa]需給氧支持治療的胎齡34周以下的早產(chǎn)兒20例作為高體積分數(shù)氧（高氧）組(吸氧體積分數(shù)＞400mL/L，吸氧時間48.00～69.00h)，住院主要原因為均患有不同程度的RDS合并呼衰。兩組患兒入院時間為出生后0.25～10.00h。并排除患有以下疾病者:(1)ABO溶血和葡萄糖-6-磷酸

3、脫氫酶(G6PD)缺陷;(2)先天性心臟病;(3)驚厥、顱內(nèi)及消化道出血者;(4)感染。經(jīng)四川醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會授權并取得家屬知情同意后，兩組早產(chǎn)兒在入院后72h經(jīng)橈動脈無菌下采血2mL置肝素抗凝管中，取新鮮抗凝血2mL與Hank's液1∶1混勻后，用吸管吸取新鮮稀釋血液沿離心管壁緩緩加到淋巴細胞分離液液面上，并水平離心后提取環(huán)狀乳白色層即外周血單個核細胞(peripheral blood mono-nuclear cell，P

4、BMC)滴于蓋玻片上，加入40 g/L多聚甲醛使之固定于蓋玻片上，用免疫組織化學方法（PV法）檢測高氧組和對照組中PBMC內(nèi)蛋白激酶C-β(PKCβ)、銜接蛋白(p66Shc)、脯氨酰異構酶(Pin1)和胞質(zhì)磷酸化p66Shc-Ser36蛋白的表達，在倒置相差顯微鏡下觀察，陽性著色為黃色或棕黃色顆粒。用熒光顯微鏡技術檢測線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，陽性顯色為紅色熒光。
　　結果:1

5、.對照組與高氧組早產(chǎn)兒PKCβ蛋白表達情況:陽性表達染色為金黃色和黃褐色位于胞質(zhì)，與對照組相比，高氧組細胞內(nèi)PKCβ的表達明顯增加，差異有顯著性（t=21.139，P＜0.001）;2.對照組與高氧組早產(chǎn)兒p66Shc蛋白表達情況:陽性表達染色為金黃色和黃褐色大部分位于胞質(zhì)。與對照組相比，高氧組細胞內(nèi)p66Shc的表達明顯增加，差異有顯著性(t=5.592，P＜0.001);3.對照組與高氧組早產(chǎn)兒 Pin1蛋白表達情況:陽性表達染色為

6、金黃色和黃褐色位于胞質(zhì)或胞核。與對照組相比，高氧組細胞內(nèi)Pin1的表達明顯增加，差異有顯著性(t=7.476，P＜0.001);4.對照組與高氧組早產(chǎn)兒磷酸化p66Shc Ser36蛋白表達情況:陽性表達染色為金黃色和黃褐色大部分位于胞質(zhì)。與對照組相比，高氧組磷酸化p66Shc Ser36的表達明顯增加，差異有顯著性(t=16.895,P＜0.001);5.線粒體ROS呈紅色熒光，正常對照組紅色熒光較弱，與對照組相比，高氧組紅色熒光明顯

7、增強，活性氧產(chǎn)生增加，差異具有統(tǒng)計學意義(t=10.586,P＜0.001);6.高氧組活性氧的產(chǎn)生與PKCβ、p66Shc、Pin1和磷酸化p66Shc Ser36蛋白表達呈正相關關系(r=0.893、0.795、0.681、0.663，P均＜0.001)。
　　結論:高氧能誘導人PBMC內(nèi)PKCβ、P66Shc、Pin1和磷酸化p66Shc Ser36蛋白表達增多，線粒體ROS產(chǎn)生增多，證明PKCβ/p66Shc氧化應激信號通