活性氧介導(dǎo)的胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與鎘致畸作用.pdf

1、目的:孕期母體鎘暴露引起胎兒畸形和生長發(fā)育遲緩,而眾多研究提示母體鎘不能透過胎盤屏障。本研究主要探討胎盤損傷在鎘致畸中作用,并初步研究胎盤氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在鎘引起胎盤損傷中的作用。方法:本研究主要由4個(gè)實(shí)驗(yàn)組成。實(shí)驗(yàn)一:建立鎘引起小鼠畸形模型。孕鼠被隨機(jī)分為2組,鎘處理組小鼠于受孕第9天經(jīng)腹腔單次給予氯化鎘(CdCl2,4.5 mg/kg),對照組孕鼠給予等容積生理鹽水。于受孕第18天剖殺所有孕鼠,剖宮取胎鼠,記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)

2、和吸收胎數(shù),測量胎鼠身長,稱活胎和胎盤重量,并評價(jià)胎鼠外觀畸形。實(shí)驗(yàn)二:評價(jià)胎盤病理損傷。孕鼠被隨機(jī)分為2組,鎘處理組小鼠于受孕第9天經(jīng)腹腔單次給予CdCl2(4.5 mg/kg),對照組孕鼠給予等容積生理鹽水。先于孕第10天剖殺半數(shù)孕鼠,收集胎盤進(jìn)行增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)染色;接著于小鼠受孕第18天剖殺剩余孕鼠,收集胎盤進(jìn)行常規(guī)HE染色檢查和細(xì)胞凋亡檢測。實(shí)驗(yàn)三:檢測胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激。孕鼠被隨機(jī)分為2組,鎘處理

3、組小鼠于受孕第9天經(jīng)腹腔單次給予CdCl2(4.5 mg/kg),對照組孕鼠給予等容積生理鹽水。為探討鎘誘導(dǎo)的小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系,鎘處理后不同時(shí)點(diǎn)(2 h、8 h和24 h)剖殺對照組和鎘處理組孕鼠,收集胎盤,用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因[葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶-Ⅰ樣蛋白(EDEM)]的含量;用免疫印跡法檢測胎

4、盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白[GRP78、磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)、C/EBP同源蛋白(CHOP)]的表達(dá)水平。此外,本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了胎盤還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測定,并用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測胎盤氧化應(yīng)激相關(guān)基因HO-1和iNOS的含量;用免疫印跡法檢測胎盤氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白[三硝化酪氨酸(3-NT)、血紅素加氧酶(HO-1)]的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)四:觀察活性氧是否介導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。孕鼠被隨機(jī)分成4組,鎘處理組小鼠于受孕

5、第9天經(jīng)腹腔單次給予CdCl2(4.5 mg/kg),單純PBN組小鼠于受孕第9天經(jīng)腹腔間隔4 h分兩次給予2-苯叔丁基硝酮(PBN,100 mg/kg),PBN干預(yù)組小鼠經(jīng)腹腔給予CdCl2(4.5 mg/kg)處理前30 min和處理后4 h分別給予PBN(100 mg/kg,ip)。對照組孕鼠于受孕第9天給予等容積生理鹽水,于鎘處理8h后剖殺所有孕鼠,收集胎盤,并用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP和基因胎盤氧化應(yīng)

6、激HO-1基因的含量;用免疫印跡法檢測胎盤氧化應(yīng)激(3-NT、HO-1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(GRP78、CHOP和peIF2α)的相關(guān)蛋白表達(dá)水平;用免疫組織化學(xué)染色法對胎盤3-NT及HO-1蛋白進(jìn)行定位。結(jié)果:孕期母體鎘暴露明顯升高窩胎鼠指(趾)部和尾部畸形率,顯著降低胎鼠身長、活胎重和胎盤重。胎盤組織HE染色結(jié)果顯示,胎盤迷路層的平均血竇區(qū)域明顯減少;免疫組織化學(xué)結(jié)果表明,鎘處理組小鼠胎盤迷路層PCNA陽性增殖細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少;TU

7、NEL結(jié)果發(fā)現(xiàn),鎘處理小鼠胎盤迷路層TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較對照組顯著増多。孕期母體鎘處理8 h后,小鼠胎盤組織GRP78和ATF4 mRNA水平明顯升高,且胎盤組織GRP78、peIF2α和CHOP蛋白表達(dá)顯著上調(diào),這提示孕期鎘暴露明顯誘導(dǎo)小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。此外,孕期母體鎘暴露明顯降低胎盤組織中還原型GSH含量,顯著上調(diào)胎盤HO-1和3-NT蛋白表達(dá),這提示孕期鎘暴露明顯誘導(dǎo)小鼠胎盤氧化應(yīng)激。進(jìn)一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),自由基清除劑PBN處理