ACE、PAs和TGF-β1對血管成形術(shù)后再狹窄作用的實驗研究.pdf

1、目的:①建立大鼠頸動脈再狹窄模型，原位灌注固定取材。評價卡托普利對血管成形術(shù)(PTA)后再狹窄的影響，分析卡托普利對血管再狹窄的干預(yù)作用。②觀察PTA后不同時間血管壁纖溶酶原激活系統(tǒng)(纖溶系統(tǒng))各因子蛋白及mRNA水平表達(dá)的動態(tài)變化特點(diǎn)，分析其與血管各層厚度、面積的關(guān)系，探討纖溶系統(tǒng)在血管再狹窄過程中的變化和作用。③觀察PTA后，TGF-β1在蛋白水平及mRNA水平表達(dá)的動態(tài)變化特點(diǎn)，分析其與再狹窄的關(guān)系，探討TGF-β1在血管再狹窄過

2、程中的作用和意義。 材料和方法:1.動物模型和分組SD雄性大鼠60只，分單純損傷實驗組(單損組)、藥物干預(yù)實驗組(干預(yù)組)及對照組。單損組采用改良導(dǎo)絲法制作大鼠頸動脈再狹窄模型。干預(yù)組將卡托普利研磨成粉狀生理鹽水稀釋配制成5mg/ml溶液，分別于制模前6d開始按10mg/kg/d劑量經(jīng)灌胃針給予大鼠至術(shù)后各時間點(diǎn)。對側(cè)頸總動脈作為假手術(shù)對照組。每組各時間點(diǎn)6只大鼠，于制模后1天、4天、7天、14天及28天原位灌注固定取材。根據(jù)H

3、E染色標(biāo)本情況，選血管形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整的50個標(biāo)本，進(jìn)行后續(xù)染色及處理。 2.病理學(xué)檢查所有標(biāo)本行HE染色。對uPA、tPA、PAI-1及TGF-β1采用免疫組織化學(xué)染色，uPA及TGF-β1同時進(jìn)行原位雜交染色。 3.病理學(xué)資料圖像分析采用病理圖像分析系統(tǒng)對標(biāo)本HE染色片進(jìn)行形態(tài)計量分析并分別計數(shù)uPA、tPA、PAI-1及TGF-β1免疫組化染色片和uPA及TGF-β1原位雜交染色片內(nèi)膜、中膜、外膜陽性細(xì)胞數(shù)。

4、 結(jié)果:1.卡托普利對PTA后血管內(nèi)膜增生和重塑的影響1.1病理改變損傷后第1天可見血管內(nèi)皮剝脫，局部內(nèi)彈力板斷裂、掀起，血管中膜變薄，管腔略大，外膜無明顯變化；第4天：除以上改變外，可見少量的平滑肌細(xì)胞失去正常形態(tài)，部分血管外膜增厚；第7天：見少量新生內(nèi)膜形成，中膜、外膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增加，管腔縮??；第14天：新生內(nèi)膜進(jìn)一步增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增加顯著，血管外膜完整，外膜厚度變薄，管腔狹窄；第28天：新生內(nèi)膜明顯增厚，中膜萎縮變薄，

5、外膜厚度基本正常，動脈壁明顯增厚，管腔明顯狹窄。干預(yù)組病理改變與單損組基本一致，僅14和28天新生內(nèi)膜面積明顯減小。 1.2內(nèi)膜、中膜、外膜厚度的變化新生內(nèi)膜從第7天開始，厚度逐漸增加，到28天達(dá)峰值，中、外膜損傷后厚度無明顯變化。干預(yù)組和單損組比較血管壁三層厚度無顯著差別。 1.3血管壁各層面積的變化新生內(nèi)膜從第7天開始出現(xiàn)，面積逐漸增加，到第28天達(dá)峰值。第14、28天干預(yù)組和單損組比較新生內(nèi)膜面積有顯著差別，干預(yù)組

6、明顯減低，中、外膜面積無顯著差別。 1.4狹窄率在血管損傷后逐漸增大，到28天達(dá)峰值。與單損組比較，干預(yù)組在14天和28天狹窄率明顯變小，各時間點(diǎn)內(nèi)彈力板面積、外彈力板面積及重塑指數(shù)兩組之間無顯著差別。 2.血管壁uPA、tPA、PAI-1在血管再狹窄中的表達(dá)和意義 2.1uPA在蛋白和mRNA水平的表達(dá) 正常血管壁見少量uPA抗原陽性細(xì)胞。損傷后第1天，新生內(nèi)膜尚未形成，中膜和外膜可見少量陽性染色細(xì)胞；

7、損傷后第4天，內(nèi)膜見少量陽性細(xì)胞，中膜和外膜陽性細(xì)胞增多，以中膜為著；損傷后第7天，新生內(nèi)膜增厚，其內(nèi)見大量陽性細(xì)胞，中膜和外膜的陽性細(xì)胞仍保持在較高水平；損傷后第14天、28天，血管壁各層陽性細(xì)胞都有明顯的下降，陽性細(xì)胞主要集中在新生內(nèi)膜，中、外膜陽性細(xì)胞回到基線水平。uPA在mRNA水平的變化與抗原水平變化基本一致。干預(yù)組與單損組比較，在28天新生內(nèi)膜、7天中膜uPA蛋白水平表達(dá)顯著降低，在14天內(nèi)膜uPAmRNA表達(dá)顯著降低。單損

8、組內(nèi)、中、外膜uPA抗原和mRNA表達(dá)與各自內(nèi)、中、外膜面積及厚度無顯著相關(guān)。 2.2tPA在蛋白水平的表達(dá)正常血管壁見少量tPA蛋白表達(dá)。損傷后第1天，中膜和外膜可見少量陽性染色細(xì)胞；損傷后第4天，內(nèi)膜見少量陽性細(xì)胞，中外膜陽性細(xì)胞增多；第7天，新生內(nèi)膜表達(dá)達(dá)峰值，中外膜陽性細(xì)胞保持在較高水平；損傷后第14天、28天，血管壁各層陽性細(xì)胞都有不同程度下降，新生內(nèi)膜仍維持較高水平表達(dá)。干預(yù)組與單損組比較，tPA蛋白水平表達(dá)趨勢基本

9、一致。相關(guān)性分析表明，單損組內(nèi)膜tPA抗原表達(dá)與內(nèi)膜面積正相關(guān)，而外膜、中膜tPA抗原表達(dá)與外膜、中膜面積無顯著相關(guān)，內(nèi)膜、中膜tPA抗原表達(dá)與內(nèi)膜、中膜厚度有相關(guān)性，而外膜表達(dá)與外膜厚度無顯著相關(guān)性。 2.3PAI-1在蛋白水平的表達(dá)正常血管壁內(nèi)膜、中膜見少量陽性細(xì)胞，外膜未見陽性細(xì)胞。損傷后第1天，內(nèi)膜損傷，中膜可見少量陽性細(xì)胞，外膜未見陽性細(xì)胞；損傷后第4天，內(nèi)膜、外膜見少量陽性細(xì)胞，中膜陽性細(xì)胞明顯增多；損傷后第7天，新

10、生內(nèi)膜表達(dá)達(dá)峰值，見較多陽性細(xì)胞，中膜陽性細(xì)胞明顯減少，外膜仍有少量表達(dá)；損傷后第14天、28天，血管壁各層陽性細(xì)胞有不同程度下降，新生內(nèi)膜仍維持較高水平表達(dá)，外膜基本見不到陽性細(xì)胞。干預(yù)組與單損組比較，除干預(yù)組14、28天內(nèi)膜、第4天中膜陽性細(xì)胞表達(dá)顯著下降外，其余各組無顯著差別。相關(guān)性分析表明，單損組內(nèi)、中、外膜PAI-1抗原表達(dá)與內(nèi)、中、外膜面積及厚度無顯著相關(guān)性。單損組中膜uPA抗原與中膜PAI-1抗原表達(dá)、內(nèi)、中、外膜tPA抗

11、原與內(nèi)、中、外膜PAI-1抗原表達(dá)有相關(guān)性，而內(nèi)、外膜uPA抗原與內(nèi)、外膜PAI-1抗原表達(dá)無明顯相關(guān)。 3.TGF-β1在血管再狹窄中的表達(dá)和意義3.1單損組TGF-β1mRNA在血管壁各層的表達(dá)對照組內(nèi)膜無TGF-β1mRNA陽性細(xì)胞表達(dá)，中、外膜有少量表達(dá)。血管損傷后4天，內(nèi)膜仍無TGF-β1mRNA陽性細(xì)胞表達(dá)，中、外膜陽性細(xì)胞數(shù)增加；損傷后7天內(nèi)膜見少量陽性細(xì)胞，中膜陽性細(xì)胞達(dá)峰值，外膜陽性細(xì)胞減少；損傷后14天和28

12、天，內(nèi)膜陽性細(xì)胞數(shù)增加并于28天達(dá)峰值，中膜陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降，外膜表達(dá)稍有波動，但與對照組比較無顯著差別。干預(yù)組和單損組TGF-β1mRNA在血管壁各層表達(dá)趨勢基本一致，除干預(yù)組內(nèi)膜在28天陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降外，其余各時間點(diǎn)兩組比較無顯著差別。相關(guān)性分析結(jié)果表明，TGF-β1mRNA在血管壁各層表達(dá)與血管內(nèi)、中、外膜面積及厚度無顯著相關(guān)性。 3.2單損組TGF-β1蛋白在血管壁各層的表達(dá)損傷血管各層TGF-β1蛋白表達(dá)均較低，

13、可能與標(biāo)本處理過程中抗原破壞或丟失有關(guān)。 結(jié)論:1.卡托普利減小大鼠頸動脈損傷后新生內(nèi)膜面積及狹窄率，抑制新生內(nèi)膜形成，但不改變內(nèi)、外彈力板面積及重塑指數(shù)，不影響血管收縮性重塑。2.uPA、tPA、PAI-1抗原和uPAmRNA表達(dá)增加與新生內(nèi)膜的形成相伴隨，證實它們參與再狹窄的形成；內(nèi)膜尚未形成時uPA抗原和mRNA表達(dá)以中膜為主，內(nèi)膜形成后，表達(dá)主要集中在新生內(nèi)膜，可能與早中期增殖細(xì)胞向內(nèi)膜遷移形成新生內(nèi)膜形成有關(guān)；tPA抗